Engineered Ön Çapraz Bağ Greftlerinin Değerlendirme Atimik Rat Modeli
Summary
Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.
Abstract
Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.
Introduction
Ön çapraz bağ (ACL) yırtılması diz 1 en yaygın bağ yaralanmaları biridir. Rüptüre ACL'lere cerrahi müdahale olmadan iyileşmek mümkün olduğundan, günlük yaşam yanı sıra spora katılım faaliyetlerine sınırlamalar yılda bir milyar dolar 3 tahmini maliyeti, her yıl 2 ameliyat 175,000 üzerinde hasta götürmek. Şu anda, otogreft veya allogreft tendon ya bağ rekonstrüksiyonu için kullanılır. Yüksek başarı oranları hem otogreft ve allogreft replasmanı ile elde edilebilir olsa da, ciddi komplikasyonlar bu rekonstrüksiyon seçenekleri 4 ile ilişkilidir. Otogreft dokusu, özellikle yeniden rüptür veya çok bağ yaralanma durumlarda, donör sitesi morbidite ile ilişkilidir ve arz sınırlıdır. Öte yandan, alograft doku gecikmeli aşı entegrasyonu, yan inflamatuar yanıtı, teorik enfeksiyon riski, ve sınırlı Supp ile bağlantılıdırly 5. Sentetik olmayan parçalanabilir greftler 1970 ve 1980'lerde geliştirilen, ancak erken greft rüptürü, yabancı cisim reaksiyonu, osteoliz ve sinovit 6 engel edildi. Bu ciddi kaygılar sonucunda, Amerika Birleşik Devletleri'nde klinik kullanıma sentetik greftler şu anda.
Nedeniyle mevcut greft seçenekleri ile ve biyoloji, mühendislik ve rejeneratif tıp son gelişmeler bu sınırlamaları, ACL aşılama için bir doku mühendisliği çözeltide büyük ilgi olmuştur. Güncel doku mühendisliği stratejileri kalıcı sentetik malzeme implantasyonu 7 ile ilgili sınırlamaları kaçınarak konak doku gelişimine izin vermek için parçalanabilir biyolojik ve sentetik malzemeler kullanır.
Polikaprolakton (PCL), FDA yapışma bariyer dahil olmak üzere tıbbi uygulamalarda bir dizi için onaylanmış ve 8 pansumanla olan biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer, bu u olmuşturvasküler, kemik, kıkırdak, sinir, deri ve özofagus doku mühendisliği 5,9-16 olmak üzere geniş bir uygulama çeşitli sed. Uygun biyolojik uyumluluk, nispeten uzun bir in vivo yarı-ömrü, uygun bir mekanik mukavemet ve yüksek elastikiyet doku mühendisliği Bu polimerin popülerlik katkıda bulunur. Yara iyileşmesinin bir kemirgen modelinde, implante electrospun PCL olmayan immünojenik olduğu ve yan etkileri 13, yerel doku içine entegre olduğu gösterilmiştir. Electrospun PCL bir SEM görüntüsü, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
Hem küçük hem de büyük hayvan modellerinde geçerli FDA düzenleyici standartlar, etkinliği ve güvenliği ile Amerika Birleşik Devletleri'nde klinik çalışmalarda içine taşımak için PCL veya başka herhangi bir mühendislik ACL grefti için gerekli olacaktır. Ayrıca, in vivo koşullar genellikle in vitro doku mühendisliği ACL greft özelliklerini artırabilir. Fleksör digitor ile otolog Rekonstrüksiyon bir sıçan modelium longus tendonu daha önce yerel bir ACL, kesilmiş Femoral ve tibial tünel delinmiştir ve aşı geçirildi ve ameliyat dikiş ipliğinin 17-22 ile yerine tespit edildi ki, tarif edilmiştir. Bu yazıda, mühendislik ACL değiştirmeleri değerlendirilmesi için yerine otogreft-tabanlı yeniden (Şekil 2) için bu modelin bir değişiklik anlatacağız.
Birçok hayvan modelleri bağ doku mühendisliği için mevcut olmasına rağmen, sıçan nedenlerle bir dizi için büyük modellere göre avantajlıdır. Bu avantajlar kolay hayvancılığı ve kullanım, daha az etik hususlar ve düşük maliyet 17,23 içerir. Buna ek olarak, fare modeli kıkırdak, tendon ve kemik doku mühendisliği 24 de dahil olmak üzere ortopedik doku rejenerasyonu için bir model olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Özel olarak, atimik çıplak sıçan nihai implantasyon o sağlayan, hücre-aracılı bağışıklık karşılığının 25 kendi eksikliği nedeniyle seçilmiştirBu modelde f ksenogeneik donör hücreleri gelecekte daha da mühendislik greft geliştirmek için. Bu yöntemler yazıda ACL rekonstrüksiyonu bir atimik sıçan modelinde imalat ve acellular implantasyonu, biyolojik olarak parçalanabilen polimer greft tarif.
Protocol
Representative Results
Discussion
ACL yaralanmaları şu anda yeniden inşası için sınırlı seçenekler ile ortopedik spor cerrahisinde sık görülen bir durum vardır. In vivo olarak yeniden oluşturulmasına izin olacak ACL için uygun bir doku mühendisliği vekil geliştirmek amacıyla, uygun bir hayvan modeli gereklidir. Bir atimik sıçan ACL yeniden tekrarlanabilir bir modeli kullanarak, in vivo implantasyonu olduğu gibi bu çalışmada, biyolojik olarak parçalanabilir bir mühendislik aşı imalatı tarif edilmektedir. B…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu projenin daha önceki yineleme kendi teknik katkılarından dolayı Gabriel AROM ve Michael Yeranosian teşekkür etmek istiyorum. Bu proje OREF Klinisyen Bilim Adamı Yetiştirme Grant (NL) tarafından finanse edildi, HH Lee Cerrahi Araştırma Bursu (NL), Gaziler İdaresi BLR & Ge Merit Değerlendirme 1 I01 BX00012601 (DM) ve Kas-İskelet Nakli Vakfı Genç Araştırmacı Ödülü (FP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) | Lactel Absorbable Polymers | Custom synthesized polymer to desired molecular weight | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 105228 | Solvent for PCL polymer |
| 18G x 1 1/2"bevel needle | BD Medical | 305196 | |
| Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702101 | |
| VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver | Microgeo USA | VLS2.30 | |
| Expanded Plasma Cleaner 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification |
| PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml | Advanced Biomatrix | 5015-A | Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1N NaOH 1:9 in 1x PBS |
| Suture, 5-0 Vicryl | Henry Schein | 1086471 | |
| Suture, 4-0 Vicryl | Henry Schein | 6540072 | |
| Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) | Fisher Scientific | 8940 | |
| Buphrenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B9275 | Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control |
| Ampicillin, injectable | Henry Schein | 1185678 | Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure |
| K-wire, 1.6 mm | Spectrum Surgical | SI040062 | |
| Keith Needle, Straight 1 1/2" | Delasco Dermatology Lab & Supply | KE-112 | |
| Immunocal Decalcifying Solution | Fisher Scientific | NC9491030 | |
| Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) | US Dental Depot | OPTICRYL 100410 | |
| Instron Model 5564 Tensile Testing Machine | Instron | 5564 | Any comparable tensile testing apparatus is suitable |
Referências
- Fetto, J. F., Marshall, J. L. The natural history and diagnosis of anterior cruciate ligament insufficiency. Clin Orthop Relat Res. (147), 29-38 (1980).
- Kim, Y. M., Lee, C. A., Matava, M. J. Clinical results of arthroscopic single-bundle transtibial posterior cruciate ligament reconstruction: a systematic review. Am J Sports Med. 39 (2), 425-434 (2011).
- Andersson, C., Odensten, M., Gillquist, J. Knee function after surgical or nonsurgical treatment of acute rupture of the anterior cruciate ligament: a randomized study with a long-term follow-up period. Clin Orthop Relat Res. (264), 255-263 (1991).
- Klimkiewicz, J. J., Petrie, R. S., Harner, C. D. Surgical treatment of combined injury to anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament, and medial structures. Clin Sports Med. 19 (3), 479-492 (2000).
- Petrigliano, F. A., McAllister, D. R., Wu, B. M. Tissue engineering for anterior cruciate ligament reconstruction: a review of current strategies. Arthroscopy. 22 (4), 441-451 (2006).
- Groot, J. H., et al. Use of porous polyurethanes for meniscal reconstruction and meniscal prostheses. Biomaterials. 17 (2), 163-173 (1996).
- Leong, N. L., Petrigliano, F. A., McAllister, D. R. Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomed Mater Res A. 102 (5), 1614-1624 (2014).
- Duling, R. R., Dupaix, R. B., Katsube, N., Lannutti, J. Mechanical characterization of electrospun polycaprolactone (PCL): a potential scaffold for tissue engineering. J Biomech Eng. 130 (1), 011006 (2008).
- Shao, Z., et al. Polycaprolactone electrospun mesh conjugated with an MSC affinity peptide for MSC homing in vivo. Biomaterials. 33 (12), 3375-3387 (2012).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30 (4), 583-588 (2009).
- Wise, S. G., et al. A multilayered synthetic human elastin/polycaprolactone hybrid vascular graft with tailored mechanical properties. Acta Biomater. 7 (1), 295-303 (2011).
- Vargel, I., Korkusuz, P., Menceloğlu, Y. Z., Pişkin, E. In vivo performance of antibiotic embedded electrospun PCL membranes for prevention of abdominal adhesions. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 81 (2), 530-543 (2007).
- Cao, H., McHugh, K., Chew, S. Y., Anderson, J. M. The topographical effect of electrospun nanofibrous scaffolds on the in vivo and in vitro foreign body reaction. J Biomed Mater Res A. 93 (3), 1151-1159 (2010).
- Joshi, V. S., Lei, N. Y., Walthers, C. M., Wu, B., Dunn, J. C. Macroporosity enhances vascularization of electrospun scaffolds. J Surg Res. 183 (1), 18-26 (2013).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Vaz, C. M., van Tuijl, S., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. Design of scaffolds for blood vessel tissue engineering using a multi-layering electrospinning technique. Acta Biomater. 1 (5), 575-582 (2005).
- Kawamura, S., Ying, L., Kim, H. J., Dynybil, C., Rodeo, S. A. Macrophages accumulate in the early phase of tendon-bone healing. J Orthop Res. 23 (6), 1425-1432 (2005).
- Hays, P. L., et al. The role of macrophages in early healing of a tendon graft in a bone tunnel. J Bone Joint Surg Am. 90 (3), 565-579 (2008).
- Dagher, E., et al. Immobilization modulates macrophage accumulation in tendon-bone healing. Clin Orthop Relat Res. 467 (1), 281-287 (2009).
- Bedi, A., et al. Effect of early and delayed mechanical loading on tendon-to-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction. J Bone Joint Surg Am. 92 (14), 2387-2401 (2010).
- Bedi, A., Kawamura, S., Ying, L., Rodeo, S. A. Differences in tendon graft healing between the intra-articular and extra-articular ends of a bone tunnel. HSS J. 5 (1), 51-57 (2009).
- Fu, S. C., et al. Effect of graft tensioning on mechanical restoration in a rat model of anterior cruciate ligament reconstruction using free tendon graft. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 21 (5), 1226-1233 (2013).
- Fan, H., Liu, H., Wong, E. J., Toh, S. L., Goh, J. C. In vivo study of anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold. Biomaterials. 29 (23), 3324-3337 (2008).
- Landis, J. R., Koch, G. G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 33 (1), 159-174 (1977).
- Joshi, S. M., Mastrangelo, A. N., Magarian, E. M., Fleming, B. C., Murray, M. M. Collagen-platelet composite enhances biomechanical and histologic healing of the porcine anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 37 (12), 2401-2410 (2009).
- Leong, N. L., et al. In vitro and in vivo evaluation of heparin mediated growth factor release from tissue-engineered constructs for anterior cruciate ligament reconstruction. J Orthop Res. 10, (2014).
- Seo, Y. K., et al. Increase in cell migration and angiogenesis in a composite silk scaffold for tissue-engineered ligaments. J Orthop Res. 27 (4), 495-503 (2009).
- Freeman, J. W., Woods, M. D., Laurencin, C. T. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design. J Biomech. 40 (9), 2029-2036 (2007).
- Bashur, C. A., Shaffer, R. D., Dahlgren, L. A., Guelcher, S. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and alignment of electrospun polyurethane meshes on mesenchymal progenitor cells. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2435-2445 (2009).
- Dash, T. K., Konkimalla, V. B. Poly-є-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review. J Control Release. 158 (1), 15-33 (2012).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).
- Xu, Y., Ao, Y. F. Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).
- Shino, K., et al. Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog. J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).
- Stasiak, M. E., et al. A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).
- Brophy, R. H., et al. Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model. J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).
