Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Summary

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Abstract

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.

The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Introduction

Microscopie à force atomique (AFM) génère une image d'une surface par balayage sur une zone de l'échantillon en utilisant une console avec une pointe très fine ^1. Le mouvement de la sonde en porte à faux de la topologie de surface de l'échantillon. AFM a été largement appliquée à des molécules biologiques – y compris les protéines, l'ADN et les membranes, en raison de sa polyvalence dans l'analyse des échantillons fixés dans l'air ou de l'état quasi-native dans un liquide ^2-5.

Outre sa capacité d'imagerie à haute résolution dans l'ordre du nanomètre, le cantilever AFM agit comme un ressort pour sonder les forces d'interaction (d'adhérence et de répulsion) et les propriétés mécaniques de l'échantillon ^5,6. Ceci est connu comme la spectroscopie de force. Dans ce mode, la sonde se rapproche de la première de l'échantillon et exerce une force sur elle, puis est rentré jusqu'à ce qu'il perd le contact avec l'échantillon (figure 1A). Les courbes montrent générés force en fonction de la distance du levier à la fois pour l'applicationle gardon et la rétraction. Plusieurs propriétés, y compris le module d'élasticité pour mesurer la rigidité d'un matériau, et les forces d'adhérence peuvent être obtenues.

Bicouches lipidiques supportées sont des membranes modèles biologiques situées sur le dessus d'un support solide – habituellement le mica, le verre borosilicate, silice fondue, ou de silicium ⁷ oxydé. Ils sont préparés en utilisant différentes techniques comme le dépôt de la vésicule, de méthode et de Langmuir-Blodgett spin-coating ^8,9. Imagerie AFM a été utilisée pour suivre la formation de ces bicouches supportées ^10, et sonder différentes structures formées par des membranes de différentes compositions ^{11 à 15.}

Effectuer la spectroscopie de force sur les résultats bicouches pris en charge dans un pic dans la courbe d'approche. Ce pic indique la force nécessaire pour percer la bicouche, et est appelée force de percée. L'épaisseur de la double couche peut également être mesurée en utilisant la courbe de force ^6. La force typique de percée de bicouchescomprise entre 1-50 nN ^6. Ces propriétés dépendent de lipide emballage (liquide ou gel de phase) et la structure (longueur de chaîne acyle et le degré d'insaturation) et modifié par des agents de la membrane ¹⁶ actif. La théorie derrière la rupture a été expliqué ¹⁷ et d'autres paramètres expérimentaux tels que cantilever douceur, rayon de la pointe et de la vitesse d'approche affectent également la force de percée ^15,16,18. la spectroscopie de force a été utilisé pour analyser les propriétés des différentes phases lipidiques ^11,19, les changements de composition dépendant ^12,20, ainsi que des effets d'autres biomolécules, telles que des peptides, sur la stabilité de la membrane ^21.

Le plat d'orientation de bicouches supportées est avantageux pour combiner AFM avec d'autres méthodes telles que la résonance plasmonique de surface ²² et la microscopie à fluorescence ^11,19 pour mieux caractériser la structure et les propriétés des membranes.

Ce proto vidéo détailléecol est destiné à préparer bicouches lipidiques supportées en utilisant le dépôt de la vésicule et les analyser avec l'AFM et spectroscopie de force. Bien que les vésicules de différentes tailles peuvent être utilisés pour préparer des bicouches, ce protocole se concentre sur les petites et grandes vésicules unilamellaires. Bicouches pris en charge cette phase séparer en liquide commandé (L _o) et désordonnés (L) _d phases liquides ont été caractérisées ^11,15. La membrane est constituée de di-oléoyl-phosphatidylcholine (DOPC), la sphingomyéline (SM), et du cholestérol (Chol) à 2: 2: 1. Cette composition modèles les radeaux lipidiques, qui sont proposées à se comporter comme des plateformes importantes pour le trafic de protéines et de tri, la signalisation cellulaire et d'autres processus cellulaires ^23,24.

Protocol

1. Préparation de bicouches lipidiques supportées (SLB) 11,12,21 Préparation de lipides Mélange vésicules multilamellaires et Suspensions Préparer les tampons suivants à l'avance. Préparer tampon PBS à des concentrations de 2,7 mM de KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 et NaCl 137 mM, pH 7,2. Préparer SLB (soutenu bicouche lipidique) à des concentrations de tampon NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4. Pr…

Representative Results

Bicouches lipidiques supportées composées de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été imagées en AFM (Figure 2 AC). En raison de la composition des lipides, SM / Chol-riche et DOPC L o L d riches en phases ont été observés. Le profil de hauteur de l'imagerie AFM peut fournir des informations importantes sur la structure de la membrane. En regardant le profil de hauteur, l'épaisseur de la bicouche peut être mesurée en présence de défauts dans la membrane (figure…

Discussion

SLBS composés de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été formés sur mica vésicule après adsorption et de la rupture induite par le chlorure de calcium. Cette composition lipidique séparé en L _D et L _o phases. La phase L _o est enrichi en sphingomyéline et cholestérol est moins fluide et / plus visqueux (figure 1A) de la phase de ¹¹ _Ld. La séparation de la L _o L _d à partir de la phase se manifeste en tant que structures circ…

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398
Sphingomyelin (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C.  For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C.  For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398
Sodium chloride (NaCl), 99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Potassium chloride (KCl), 88%	Sigma	P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, molecular biology grade	AppliChem GmbH	A3724
Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness	Duran Group	2355036
Mica blocks	NSC Mica Exports Ltd.		These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Punch and Die Set	Precision Brand Products, Inc	40105
Optical Adhesive	Norland Products, Inc.	NOA 88	Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.
Laboratory Equipment Grease	Borer Chemie AG	Glisseal N
Liposome Extruder	Avestin	LiposoFast-Basic	As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf
Silicon Nitride AFM Cantilever	Bruker AFM Probes	DNP-10	Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200