Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos
Summary
We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Introduction
Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) genera una imagen de una superficie por la exploración a través de un área de la muestra utilizando un voladizo con una punta muy afilada 1. El movimiento de la voladizo sondea la topología de la superficie de la muestra. AFM ha sido ampliamente aplicado a las moléculas biológicas – incluyendo proteínas, el ADN y las membranas, debido a su versatilidad en el análisis de muestras fijadas en el aire o estado casi nativo en líquido 2-5.
Aparte de su capacidad de imagen de alta resolución en el rango nanométrico, el voladizo AFM actúa como un resorte para sondear fuerzas de interacción (adhesión) y la repulsión y las propiedades mecánicas de la muestra 5,6. Esto se conoce como espectroscopia de fuerza. En este modo, la sonda se acerca primero la muestra y ejerce una fuerza sobre él, entonces se retrae hasta que se pierde el contacto con la muestra (Figura 1A). Las curvas generadas muestran la fuerza como una función de la distancia del voladizo, tanto para la aplicacióncucaracha y retracción. Varias propiedades, incluyendo el módulo elástico para medir la rigidez de un material, y fuerzas de adhesión se pueden derivar.
Bicapas lipídicas soportados son membranas modelo biológicas situadas en la parte superior de un soporte sólido – generalmente mica, vidrio de borosilicato, sílice fundida, o silicio 7 oxidado. Ellos se preparan utilizando diversas técnicas como la deposición de la vesícula, el método Langmuir-Blodgett y spin-coating 8,9. Formación de imágenes AFM se ha utilizado para seguir la formación de estas bicapas soportadas 10, y la sonda diferentes estructuras formadas por membranas de diferentes composiciones 11-15.
Realización de espectroscopia de fuerza en bicapas soportadas resultados en un pico en la curva de enfoque. Este pico indica la fuerza necesaria para perforar la bicapa, y se llama fuerza de avance. El espesor bicapa también se puede medir usando la curva de fuerza 6. La fuerza de avance típico de bicapasrango entre 1-50 nN 6. Estas propiedades dependen de embalaje de lípidos (fase líquida o gel) y la estructura (longitud de la cadena acilo y el grado de insaturación) y alterado por agentes 16-de membrana activa. La teoría detrás de la ruptura ha sido explicada 17 y otros parámetros experimentales tales como suavidad voladizo, radio de la punta y la velocidad de enfoque también afectará la fuerza avance 15,16,18. Espectroscopia de fuerza se ha utilizado para analizar las propiedades de las diferentes fases de lípidos 11,19, cambios en la composición dependiente de 12,20, así como efectos de otras biomoléculas, como los péptidos, sobre la estabilidad de la membrana 21.
La orientación plana de bicapas soportadas es ventajoso para la combinación de AFM con otros métodos tales como resonancia de plasmón superficial 22 y microscopía de fluorescencia 11,19 para caracterizar mejor la estructura y propiedades de las membranas.
Esta detallada proto vídeocol está destinado a preparar a bicapas lipídicas apoyados mediante la deposición de vesículas y analizarlos con AFM y espectroscopia de fuerza. Mientras que las vesículas de varios tamaños se pueden usar para preparar bicapas, este protocolo se centra en pequeñas y grandes vesículas unilamelares. Bicapas soportadas que fase separada en líquido ordenado (L o) y (L d) fases desordenadas líquidos se caracterizaron 11,15. La membrana se compone de di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina (SM) y el colesterol (Chol) en 2: 2: 1. Esta composición modelos las balsas de lípidos, que se proponen a comportarse como plataformas importantes para el tráfico de proteínas y la clasificación, la señalización celular y otros procesos celulares 23,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
SLBS compuestas de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) se formaron en mica después de la adsorción de vesículas y la ruptura inducida por cloruro de calcio. Esta composición lipídica separa en L d y L o fases. La fase L o se enriquece en la esfingomielina y colesterol, y es menos fluido / más viscoso (Figura 1A) que la fase L 11 d. La separación de L o de la fase L d manifiesta como estructuras circulares elevadas por encima de los…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Max Planck, el Centro Alemán de Investigación Oncológica, la Universidad de Tubinga, y el Bundesministerium für Bildung und Forschung (subvención. No 0312040).
Damos las gracias a Eduard Hermann por ayudarnos a automatizar el análisis de los datos de la curva de la fuerza y el Dr. Jakob Suckale para una lectura cuidadosa de este manuscrito.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
| Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
| Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
| Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
| Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
| Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
| Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
| Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
| Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |
Referências
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