Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados
Summary
We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Introduction
Microscopia de força atómica (AFM) gera uma imagem de uma superfície de varrimento através de uma área da amostra, utilizando um braço de suporte com uma ponta muito afiada 1. O movimento do braço de suporte investiga a topologia de superfície da amostra. AFM tem sido amplamente aplicado para moléculas biológicas – incluindo proteínas, DNA e membranas, devido à sua versatilidade na análise de amostras fixadas no ar ou estado quase nativo em líquido 2-5.
Para além da sua capacidade de imagiologia de alta resolução em escala nanométrica, o cantilever AFM actua como uma mola para sondar forças de interacção (adesão e repulsão) e as propriedades mecânicas da amostra 5,6. Isto é conhecido como espectroscopia de força. Neste modo, a sonda se aproxima primeiro da amostra e exerce uma força sobre ele, em seguida, é retraído até que perde o contacto com a amostra (Figura 1A). As curvas geradas mostram força em função da distância do braço de suporte, tanto para a aplicaçãobarata e retração. Várias propriedades, incluindo o módulo de elasticidade para medir a rigidez de um material, e as forças de adesão pode ser derivada.
Bicamadas lipídicas suportados são membranas biológicas modelo que encontram-se no topo de um suporte sólido – geralmente mica, vidro de borosilicato, de sílica fundida, ou oxidado silício 7. Elas são preparadas utilizando várias técnicas, como a deposição de vesículas, método Langmuir-Blodgett e spin-coating 8,9. Imagiologia AFM foi utilizado para seguir a formação destas camadas duplas suportados 10, e sondar diferentes estruturas formadas por membranas de diferentes composições 11-15.
Execução de espectroscopia vigor em apoiadas resultados bicamadas em um pico na curva de abordagem. Este pico indica a força necessária para perfurar a camada dupla, e é chamada força de avanço. A espessura da bicamada pode também ser medido usando a curva de força 6. A força típica avanço de bilayersintervalo entre 1-50 nN 6. Estas propriedades dependem embalagem lípido (fase líquida ou gel) e da estrutura (comprimento da cadeia acilo e grau de insaturação) e alterado pelos agentes activos de membrana 16. A teoria por trás da ruptura foi explicada 17 e outros parâmetros experimentais, tais como maciez cantilever, raio de ponta e velocidade de aproximação também afetam a força de avanço 15,16,18. Espectroscopia de força foi usado para analisar as propriedades de diferentes fases lipídicas 11,19, dependente da composição alterações 12,20, bem como os efeitos de outras biomoléculas, tais como péptidos, sobre a estabilidade da membrana 21.
A orientação plana de bicamadas suportados é vantajoso para a combinação de AFM com outros métodos tais como ressonância 22 e microscopia de fluorescência de plasma de superfície 11,19 para caracterizar melhor a estrutura e as propriedades das membranas.
Este proto vídeo detalhadacol destina-se a preparar bicamadas lipídicas suportados usando deposição de vesículas e analisá-los com a AFM e espectroscopia de força. Enquanto vesículas de diferentes tamanhos podem ser utilizados para preparar bicamadas, este protocolo concentra-se em pequenos e grandes vesículas unilamelares. Bilayers suportados que separam em fase líquida ordenou (L o) e (L d) fases líquidas desordenados foram caracterizados 11,15. A membrana é composta de di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina (SM), e colesterol (Chol) a 2: 2: 1. Esta composição modelos as jangadas lipídicas, que são propostas para se comportar como plataformas importantes para o tráfico de proteína e de triagem, sinalização celular e outros processos celulares 23,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
SLBS compostos de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) foram formadas em mica após adsorção vesícula e ruptura induzida por cloreto de cálcio. Esta composição de lípido separado em L e L o d fases. A fase L o é enriquecida em esf ingomielina e colesterol e é menos fluido / mais viscoso (Figura 1A) do que a fase L d 11. A separação de fase a partir de L o G d manifesta como estruturas circulares elevados acima da circundante (Figur…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Max Planck Society, o alemão Cancer Research Center, da Universidade de Tübingen, eo Bundesministerium für Bildung und Forschung (conceder nenhum. 0.312.040).
Agradecemos Eduard Hermann por nos ajudar a automatizar a análise dos dados curva de força e Dr. Jakob Suckale para a leitura cuidadosa deste manuscrito.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
| Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
| Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
| Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
| Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
| Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
| Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
| Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
| Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |
Referências
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