Атомно-силовая микроскопия изображений и силовая спектроскопия поддерживаемых липидного бислоя
Summary
We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Introduction
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) генерирует изображение поверхности путем сканирования через область образца с помощью кантилевера с очень острым наконечником 1. Движение кантилевера зондов топологии поверхности образца. АСМ широко применяется для биологических молекул – в том числе белков, ДНК и мембран, благодаря своей универсальности в анализе основных образцов в воздухе или вблизи родного государства в жидком 2-5.
Помимо своей способности изображения с высоким разрешением в нанометровом диапазоне, консольные АСМ действует как пружина, чтобы исследовать силы взаимодействия (адгезионные и отталкивания) и механические свойства образца 5,6. Это известно как силовой спектроскопии. В этом режиме датчик первая подходы образец и оказывает силовое воздействие на него, а затем втягивается, пока он не теряет контакт с образцом (фиг.1А). Сформированные кривые показывают силы как функции расстояния от кантилевера, как для приложенияплотва и отвод. Некоторые свойства, включая модуль упругости для измерения жесткости материала, и силы адгезии могут быть получены.
Поддерживаемые липидных бислоев биологические модели мембраны, лежащие на верхней части твердой подложке – обычно слюда, боросиликатное стекло, плавленый кварц, или окисленного кремния 7. Они готовятся с использованием различных методов, как осаждения везикул, метод Ленгмюра-Блоджетт и спин-покрытия 8,9. АСМ была использована, чтобы следовать за формирование этих поддерживаемых бислоев 10, и зонд различные структуры, образованные мембранами различных композиций 11-15.
Выполнение силовой спектроскопии на поддерживаемых Бислои результатов в пик на кривой подхода. Этот пик указывает на усилие, необходимое для прокалывания бислой, и называется прорывом силой. Толщина бислой можно также измерить с помощью силы кривая 6. Типичный прорыв сила бислоямиДиапазон между 1-50 NN 6. Эти свойства зависят от липидного упаковки (жидкостью или гелем фаза) и структуры (ацил длины цепи и степени ненасыщенности) и изменено мембранных-активных веществ 16. Теория за разрыва было объяснено 17 и другие экспериментальные параметры, такие как консольной мягкости, радиус наконечника и скорости захода на посадку также влияют на прорыв силу 15,16,18. Сила спектроскопии был использован для анализа свойств различных фаз липидов, состав 11,19-зависимой изменений 12,20, а также влияния других биомолекул, таких как пептиды, на стабильность мембраны 21.
Плоская ориентация поддерживаемых бислоев выгодно для объединения АСМ с другими методами, такими как поверхностный плазмонный резонанс 22 и флуоресцентной микроскопии 11,19, чтобы лучше охарактеризовать структуру и свойства мембран.
Это подробное видео протокол предназначен для подготовки поддерживаемые бислоев путем осаждения везикул и анализировать их с АСМ и силовой спектроскопии. В то время как пузырьки различных размеров могут быть использованы для получения двойных слоев, этот протокол фокусируется на малых и больших однослойных везикул. Поддерживаемые бислои, что разделение фаз в жидкость приказал (Л О) и жидких (неупорядоченных L D) фазы характеризуются 11,15. Мембрана состоит из ди-олеоил-фосфатидилхолина (DOPC), сфингомиелина (SM), и холестерина (Хол) в 2: 2: 1 отношение. Эта композиция модели липидные рафты, которые предлагаются для себя в качестве платформ для торговли важных белков и сортировки, клеточной сигнализации и других клеточных процессов. 23,24
Protocol
Representative Results
Discussion
SLBS состоящие из DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) были сформированы на слюде после везикул адсорбции и разрыва, индуцированного хлоридом кальция. Это липидный состав разделяется на L D и L O фаз. Л О фаза обогащается сфингомиелин и холестерина и меньше жидкости / более вязким (1А), че…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Общества Макса Планка, в Немецкий центр исследований рака, Университет Тюбингена, и Bundesministerium für Bildung унд Forschung (грант №. 0312040).
Мы благодарим Эдуарда Германа за помощь в автоматизации анализа данных кривой силы и д-р Якоб Suckale для внимательного прочтения этой рукописи.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
| Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
| Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
| Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
| Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
| Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
| Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
| Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
| Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |
Referências
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
- Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
- Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -. C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
- Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
- Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F., Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. . Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. , (2012).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
- Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
- Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
- Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. . ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
- Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
- Domènech, &. #. 2. 1. 0. ;., Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
- Domènech, &. #. 2. 1. 0. ;., Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
- Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
- Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
- Butt, H. -. J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
- Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
- Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
- Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
- García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
- Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
- Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
- Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
- Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
- Butt, H. -. J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
- Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
- Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
- Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
- Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
- Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
- Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
- Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
- Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
- Rigaud, J. -. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).
