الدراسات انجذاب كهربي من الرئة خلايا سرطان باستخدام القنوات المتعددة ثنائي الكهربائية الميدان ميكروفلويديك رقاقة
Summary
Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.
Abstract
يشار إلى سلوك الهجرة الخلية الاتجاه في ظل المباشر التيار الكهربائي الميدان (dcEF) على أنها انجذاب كهربي. وقد تجلى دور كبير الفسيولوجية dcEF في توجيه حركة الخلية أثناء تطور الجنين، تمايز الخلايا، والتئام الجروح في العديد من الدراسات. من خلال تطبيق رقائق ميكروفلويديك لمقايسة انجذاب كهربي، هو تقصير عملية التحقيق ويتم الحد من الأخطاء التجريبية. في السنوات الأخيرة، وأجهزة ميكروفلويديك المصنوعة من المواد البوليمرية (على سبيل المثال، البولى، PMMA، أو الاكريليك) أو (PDMS) polydimethylsiloxane استخدمت على نطاق واسع في دراسة ردود الخلايا لالتحفيز الكهربائي. ولكن، على عكس العديد من الخطوات اللازمة لصنع جهاز PDMS، وبناء بسيط وسريع للالصغرى الاكريليك فلوريدا رقاقة uidic يجعلها مناسبة لكلا النماذج الجهاز والإنتاج. إلا أن أيا من الأجهزة وذكرت تسهيل دراسة كفاءة المادة الكيميائية وهندسة المدنية في وقت واحدالآثار و على الخلايا. في هذا التقرير، وصفنا لدينا تصميم وتصنيع والمتعددة القائمة على الاكريليك المزدوج الكهربائي الميدان (MDF) رقاقة لدراسة تأثير المتزامنة الكيميائية والتحفيز الكهربائي على خلايا سرطان الرئة. يوفر رقاقة MDF ثماني مجموعات من التحفيز الكهربائية / الكيميائية في اختبار واحد. رقاقة ليس فقط يقصر كثيرا من الوقت تجريبي مطلوب ولكن أيضا يزيد من دقة في انجذاب كهربي الدراسات.
Introduction
يشار إلى سلوك الخلايا الملتصقة تتحرك باتجاه القطب الموجب أو السالب تحت المباشر التيار الكهربائي الميدان (dcEF) على أنها انجذاب كهربي. سلوك electrotactic الخلايا يلعب دورا هاما في تكوين الجنين، وتجديد الأعصاب، والتئام الجروح. وقد أظهرت 1 الخلايا السرطانية مثل خلايا سرطان البروستاتا الفئران، الخلايا السرطانية 2 الثدي، 3 والرئة خلايا غدية 4-8 الحركة electrotactic تحت dcEF تطبيقها . وقد تم قياس EF الفسيولوجية في أنسجة الغدة. كما تم الإبلاغ عن 9،10 انجذاب كهربي في الخلايا السرطانية، الغدة المرتبطة بها. 2،3 مجتمعة، ويعتبر انجذاب كهربي للخلايا السرطانية أن يكون عاملا ورم خبيث. 11 التحكم في التوجيه الكهربائي الخلايا السرطانية تحت dcEF قد تكون فكرة ممكنة لعلاج السرطان في المستقبل. ومع ذلك، اليوم، آلية جزيئية التفصيلية للانجذاب كهربي لا تزال موضع جدل. لذلك، تحقيقا في الوقود النووي المشعluence من التحفيز الكهربائي على الهجرة الخلايا السرطانية يمكن أن يسهل وضع استراتيجيات لعلاج السرطان.
مؤخرا، تم ملفقة الأجهزة الحيوية ميكروفلويديك لدراسة الاستجابات الخلوية في التدفق قوة القص، 12 التدرجات الكيميائية و 13 و الكهربائية المحفزات 4 في المختبر. وقد خفضت تصنيع الأجهزة الحيوية ميكروفلويديك باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) أو البولى (PMMA، المعروف أيضا باسم الاكريليك) بنجاح على معدل فشل هذه التجارب. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام أجهزة ميكروفلويديك القائمة على الاكريليك كنموذج للتحقيق في موضوعات البيولوجية هو أبسط من استخدام PDMS رقائق البطاطس. وقد وضعت العديد من الوظائف في الأجهزة القائمة على الاكريليك لانجذاب كهربي الدراسة. ومع ذلك، فإن أيا من التصاميم السابقة وتمكن من اختبار في وقت واحد آثار الظروف الكيميائية المختلفة و-الحقل الكهربائي في الخلايا للانجذاب كهربي الدراسة. وهكذا، قمنا بتطوير جهاز لميكروفلويديك موltichannel المزدوج الكهربائي الميدان (MDF) أربع قنوات ثقافة مستقلة وثمانية ظروف تجريبية مختلفة في رقاقة واحدة تحتوي على رقاقة.
وMDF رقاقة القائمة على الاكريليك، لاول مرة من قبل هوى وآخرون، 8 يدمج التحفيز الكهربائي وعدة قنوات معزولة كيميائيا. هذه القنوات معزولة كيميائيا يمكن استخدامها لثقافة أنواع مختلفة من الخلايا في تجربة واحدة. يتم إنتاج dcEF في القنوات التي كتبها إمدادات الطاقة الكهربائية. حقلين الكهربائية المستقلة، واحدة مع التطبيقية القوة الكهربائية الميدان (EFS) وآخر مع 0 EFS، تجري في كل قناة معزولة كيميائيا. وبهذه الطريقة، يوفر رقاقة EF التعايش أفضل تسيطر عليها والتحفيز الكيميائي. وعلاوة على ذلك، نتائج المحاكاة العددية للنشر الكيميائية داخل الرقاقة MDF تشير إلى أن عدم وجود تلوث عبر وقعت بين القنوات بعد فترة تجريبية 24 ساعة. 8
مقارنة ديفيم ذكرت لي وآخرون، 14 رقاقة MDF يوفر مساحة الثقافة الأوسع، والذي يسمح لمزيد من التحليل الكيميائي للخلايا حفز كهربائيا. بالإضافة إلى ذلك، مع منطقة مراقبة أكبر شريحة MDF، والمزيد من الخلايا يمكن ملاحظة في الاختبار، وبالتالي فإن تحليل سرعة الهجرة أو توجيه الأعضاء من الخلايا حفز كهربائيا هو أكثر دقة. تصاميم رقاقة على قناة واحدة من الدراسات السابقة التي أبلغ عنها هوانغ وآخرون. (4) وتساي وآخرون 15 تسمح سوى نوع واحد من الخلايا او كيميائية لفحصها. ومع ذلك، فإن رقاقة MDF يمكن استخدامها لتحقيق آثار المواد الكيميائية المختلفة على انجذاب كهربي، فضلا عن آثار التحفيز الكهربائي على أنواع مختلفة من الخلايا. وبعبارة أخرى، فإن رقاقة MDF يسمح لدراسة كفاءة تبعيات الجرعة الكيميائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وجدنا عملية الانضمام محولات الاكريليك على طبقة 1 من الشريحة MDF إلى أن تكون خادعة. تطبيق فقط 1-2 ميكرولتر من الغراء سوبر كافية وثبتك على محول على رقاقة MDF. أدت كميات أكبر من الغراء في بلمرة غير مكتملة من الغراء عظمى، وعدم الالتزام. مرة واحدة تم الالتزام محولات الاكريليك ب?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24×60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| Teflon tube | HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan | UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING | outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scientific |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| indium tin oxide glass (ITO glass) | AimCore Technology Co., Ltd | TN/STN, ≦10Ω | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
Referências
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Hsu, W. -. C., Jhang, J. -. H., Young, T. -. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
