Electro Studium der Lungenkrebszellen unter Verwendung eines Mehrkanal-Zwei elektrischen Feldes Mikrofluidik-Chip
Summary
Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.
Abstract
Das Verhalten des Richtzellmigration unter einem elektrischen Gleichstromfeld (dcEF) als Elektrotaxis bezeichnet. Die bedeutende Rolle von physiologischen dcEF in Führungszellbewegung während der Embryonalentwicklung, Zelldifferenzierung und bei der Wundheilung wurde in vielen Studien gezeigt worden. Durch Anlegen Mikrofluidik-Chips mit einem electro Assay wird der Untersuchungsprozess verkürzt und experimentelle Fehler minimiert werden. In den letzten Jahren mikrofluidischen Vorrichtungen Polymersubstanzen (beispielsweise Polymethylmethacrylat, PMMA, oder Acryl) oder Polydimethylsiloxan (PDMS) wurden weithin bei der Untersuchung der Reaktionen von Zellen auf eine elektrische Stimulation verwendet wird. Im Gegensatz zu den zahlreichen Schritte erforderlich, um eine PDMS-Gerät herzustellen, macht jedoch den einfachen und schnellen Aufbau der Acrylmikro fluidischen Chip ist für beide Geräte Prototyping und die Produktion geeignet. Die effiziente Untersuchung der simultanen chemischen und dcE noch keiner der gemeldeten Geräten erleichternF Wirkungen auf Zellen. In diesem Bericht beschreiben wir unsere Konstruktion und Herstellung eines Acrylbasierten Multichannel-Dual-elektrischen Feldes (MDF) Chip, um die gleichzeitige Wirkung der chemischen und elektrischen Stimulation auf Lungenkrebszellen zu untersuchen. Die MDF-Chip bietet acht Kombinationen von elektrischen / chemischen Reize in einem einzigen Test. Der Chip nicht nur stark verkürzt die erforderliche Versuchszeit, sondern erhöht auch die Genauigkeit in electro Studien.
Introduction
Das Verhalten von adhärenten Zellen sich in Richtung einer Anode oder Kathode unter einem elektrischen Gleichstromfeld (dcEF) als Elektrotaxis bezeichnet. Die electrotactic Verhalten von Zellen spielt eine wichtige Rolle in der Embryogenese, die Nervenregeneration und Wundheilung. 1-Tumorzellen wie Ratte Prostatakrebszellen, Brustkrebszellen, 2, 3 und Lungenadenokarzinomzellen 4-8 haben electrotactic Bewegung unter einem angelegten dcEF gezeigten . Die physiologische EF in Drüsengeweben gemessen. 9,10 electro wurde auch in Drüse assoziierten Tumorzellen berichtet. 2,3 Zusammen bilden die Elektrotaxis von Krebszellen wird als Metastasierung Faktor. 11 Steuerung der elektrischen Leitung von Krebszellen unter dcEF kann ein möglicher Ansatz für die zukünftige Behandlung von Krebs. Heute bleibt jedoch die detaillierte molekulare Mechanismus electro umstritten. Daher eine Untersuchung der influence der elektrischen Stimulation auf Krebszellmigration können die Entwicklung von Strategien für die Krebsbehandlung zu erleichtern.
Vor kurzem haben Bio-Mikrofluidik-Vorrichtungen für die Untersuchung zellulärer Reaktionen in vitro fließen Scherkraft, 12 chemische Gradienten, 13 und elektrische Reize 4 hergestellt worden. Die Herstellung von Bio-Mikrofluidik-Vorrichtungen mit Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Polymethylmethacrylat (PMMA, als Acryl bekannt) erfolgreich verringert die Ausfallrate solcher Experimente. Darüber hinaus mit Acrylbasis mikrofluidischen Vorrichtungen als Prototyp für die Untersuchung von biologischen Fächern ist einfacher als mit PDMS-Chips. Verschiedene Funktionen in Acrylbasis Geräte sind für die Elektrotaxis Studie entwickelt. Jedoch keine der vorgenannten Ausführungen sind in der Lage, gleichzeitig zu testen, die Auswirkungen von verschiedenen chemischen Bedingungen und die elektrische Feld auf Zellen für electro Studie. So eine Mikrofluidikvorrichtung-MU entwickelten wirltichannel Dual-elektrischen Feldes (MDF) Chip-haltigen vier unabhängige Kulturkanäle und acht verschiedenen experimentellen Bedingungen in einem Chip.
Die auf Acrylbasis MDF-Chip, die zuerst von Hou et al berichtet., 8 integriert elektrische Stimulation und mehrere chemisch getrennte Kanäle. Diese chemisch isoliert Kanäle können zur Kultur verschiedene Arten von Zellen in einem Experiment verwendet werden. Die dcEF in den Kanälen wird durch eine elektrische Stromversorgung hergestellt wird. Zwei unabhängige elektrische Felder, eine mit angelegten elektrischen Feldstärke (EFS) und ein weiteres mit 0 EFS, sind in jedem chemisch isolierten Kanal durchgeführt. Auf diese Weise bietet der Chip besser gesteuert koexistierenden EF und chemische Stimulation. Ferner ergibt sich aus der numerischen Simulation der chemischen Diffusion innerhalb der MDF-Chips anzuzeigen, dass keine Kontamination zwischen den Kanälen nach 24 h Versuchsdauer aufgetreten. 8
Gegenüber dem Device von Li berichtet, et al., bietet 14 der MDF-Chip einen größeren Kulturbereich, der für die weitere biochemische Analyse der elektrisch stimulierten Zellen ermöglicht. Zusätzlich mit größeren Beobachtungsbereich der MDF-Chips, mehr Zellen können in dem Test beobachtet werden, so dass die Analyse der Migrationsgeschwindigkeit bzw. Gerichtetheit der elektrisch stimulierten Zellen ist genauer. Einkanal-Chip-Designs früherer Studien von Huang et al. 4 und Tsai et al. 15 berichtet erlauben nur einen Zelltyp oder zu testenden Chemikalie. Jedoch kann die MDF-Chip verwendet, um die Wirkungen von verschiedenen Chemikalien auf electro sowie die Wirkungen der elektrischen Stimulation auf verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. Mit anderen Worten ermöglicht die effiziente Untersuchung von chemischen Dosis Abhängigkeiten der MDF-Chip.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben den Prozess der haftenden Acryladapter auf Schicht 1 des MDF-Chip tricky sein. Der Einsatz von nur 1 bis 2 & mgr; l Superkleber ist ausreichend, um fest zu halten den Adapter auf die MDF-Chip. Größere Mengen von Kleber führte zu einer unvollständigen Polymerisation der Superkleber und Misserfolg zu haften. Sobald die Acryl-Adapter wurden fest auf das MDF-Chip geklebt, Flüssigkeitsleckage in der mikrofluidischen System nur selten aufgetreten. Außerdem O / N Inkubation in der Vakuumkammer dazu beigetra…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24×60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| Teflon tube | HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan | UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING | outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scientific |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| indium tin oxide glass (ITO glass) | AimCore Technology Co., Ltd | TN/STN, ≦10Ω | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
Referências
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