Estudios electrotaxis de pulmón células de cáncer utilizando un Multicanal Dual-campo eléctrico chip de microfluidos
Summary
Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.
Abstract
El comportamiento de la migración celular direccional bajo una corriente de campo eléctrico directo (dcEF) se conoce como electrotaxis. El papel importante de dcEF fisiológica en guiar el movimiento celular durante el desarrollo embrionario, la diferenciación celular, la curación de heridas y se ha demostrado en muchos estudios. Mediante la aplicación de chips de microfluidos a un ensayo electrotaxis, el proceso de investigación se acorta y los errores experimentales se reducen al mínimo. En los últimos años, los dispositivos de microfluidos hechas de sustancias poliméricas (por ejemplo, polimetilmetacrilato, PMMA, o acrílico) o polidimetilsiloxano (PDMS) han sido ampliamente utilizados en el estudio de las respuestas de las células a la estimulación eléctrica. Sin embargo, a diferencia de los numerosos pasos requeridos para fabricar un dispositivo de PDMS, la construcción simple y rápida de los micro acrílicos fl chip de uidic hace que sea adecuado tanto para la creación de prototipos dispositivo y la producción. Sin embargo, ninguno de los dispositivos reportados facilitar el estudio eficiente de la sustancia química simultánea y DCEF efectos sobre las células. En este informe, describimos nuestro diseño y fabricación de un multicanal basado en acrílico de campo eléctrico dual (MDF) de chips para investigar el efecto simultáneo de química y la estimulación eléctrica de las células del cáncer de pulmón. El chip MDF proporciona ocho combinaciones de estímulos eléctricos / químicos en una sola prueba. El chip no sólo acorta considerablemente el tiempo experimental requerido sino también aumenta la precisión en electrotaxis estudios.
Introduction
El comportamiento de las células adherentes que se mueven hacia un ánodo o cátodo bajo una corriente de campo eléctrico directo (dcEF) se conoce como electrotaxis. El comportamiento electrotactic de las células juega un papel importante en la embriogénesis, la regeneración del nervio, y la curación de la herida. 1 Las células tumorales tales como células de cáncer de próstata de rata, células de cáncer de mama 2, 3 y pulmonares células de adenocarcinoma 4-8 han demostrado movimiento electrotactic bajo una dcEF aplicado . El EF fisiológica se ha medido en tejidos de la glándula. 9,10 electrotaxis También se ha informado en las células tumor de la glándula asociada a 2,3. Tomados en conjunto, los electrotaxis de células de cáncer se considera que es un factor de metástasis. 11 El control de la orientación eléctrica de las células cancerosas en virtud de dcEF puede ser un enfoque potencial para el tratamiento futuro de cáncer. Sin embargo, hoy en día, el mecanismo molecular detallado de electrotaxis sigue siendo controvertido. Por lo tanto, una investigación de la influence de la estimulación eléctrica sobre la migración de células de cáncer puede facilitar el desarrollo de estrategias para el tratamiento del cáncer.
Recientemente, los dispositivos bio-microfluidos se han fabricado para el estudio de las respuestas celulares a fluir la fuerza de corte, 12 gradientes químicos, 13 y eléctrica estímulos 4 in vitro. La fabricación de dispositivos de microfluidos utilizando bio-polidimetilsiloxano (PDMS) o polimetilmetacrilato (PMMA, también conocido como acrílico) ha reducido con éxito la tasa de fracaso de tales experimentos. Por otra parte, el uso de dispositivos de microfluidos de base acrílica como un prototipo para la investigación de temas biológicos es más simple que el uso de chips de PDMS. Varias funciones en los dispositivos de base acrílica se han desarrollado para electrotaxis estudio. Sin embargo, ninguno de los diseños anteriores son capaces de probar simultáneamente los efectos de varias condiciones químicas y el campo eléctrico en las células para electrotaxis estudio. Por lo tanto, hemos desarrollado un dispositivo de microfluidos-multichannel doble de campo eléctrico (MDF) cuatro canales de cultivo independientes y ocho condiciones experimentales diferentes en un chip que contiene chips.
El chip de MDF de base acrílica, primero reportada por Hou et al., 8 integra la estimulación eléctrica y varios canales aislados químicamente. Estos canales aislados químicamente se pueden utilizar para la cultura diferentes tipos de células en un experimento. El dcEF en los canales es producida por una fuente de alimentación eléctrica. Dos campos eléctricos independientes, uno con la fuerza aplicada de campo eléctrico (EFS) y otro con 0 EFS, se llevan a cabo en cada canal aislado químicamente. De esta manera, el chip proporciona EF coexistente mejor controlado y la estimulación química. Además, los resultados de la simulación numérica de la difusión química dentro del chip MDF indican que no se produjo la contaminación cruzada entre los canales después de un periodo experimental de 24 hr. 8
En comparación con el Device reportado por Li et al., 14 el chip MDF proporciona un área de cultivo a mayor, lo que permite para su posterior análisis bioquímico de las células estimuladas eléctricamente. Además, con área de observación más grande del chip MDF, más células pueden ser observados en la prueba, por lo que el análisis de la velocidad de migración o direccionalidad de las células estimuladas eléctricamente es más preciso. Los diseños de chips de un solo canal de estudios previos reportados por Huang et al. 4 y Tsai et al. 15 sólo permiten un tipo de célula o químico a ensayar. Sin embargo, el chip MDF puede utilizarse para investigar los efectos de diversos productos químicos en electrotaxis, así como los efectos de la estimulación eléctrica en diferentes tipos de células. En otras palabras, el chip MDF permite el estudio de dosis eficaz de dependencias químicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nos pareció que el proceso de adherirse adaptadores de acrílico en la capa 1 del chip MDF a ser complicado. La aplicación de sólo 1 a 2 l de pegamento es suficiente para adherirse firmemente el adaptador en el chip de MDF. Grandes cantidades de cola como resultado una polimerización incompleta del pegamento y la falta de adhesión. Una vez que los adaptadores de acrílico estaban firmemente adherido sobre el chip MDF, fuga de líquido en el sistema de microfluidos rara vez se produjo. Además, O / N de incubación …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24×60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| Teflon tube | HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan | UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING | outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scientific |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| indium tin oxide glass (ITO glass) | AimCore Technology Co., Ltd | TN/STN, ≦10Ω | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
Referências
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Hsu, W. -. C., Jhang, J. -. H., Young, T. -. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
