Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic
Summary
Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.
Abstract
ההתנהגות של נדידת תאים כיוונית תחת שדה חשמלי הנוכחי ישיר (dcEF) נקראת electrotaxis. התפקיד המשמעותי של dcEF הפיזיולוגי במנחים תנועת תא במהלך התפתחות עובר, התמיינות תאים, וריפוי פצע הודגם במחקרים רבים. על ידי יישום שבבי מייקרו-נוזליים לassay electrotaxis, תהליך החקירה מתקצר ושגיאות ניסיוניות הן מזעריות. בשנים האחרונות, מכשירי microfluidic עשויים חומרים פולימריים (לדוגמא, polymethylmethacrylate, PMMA, או אקריליק) או polydimethylsiloxane (PDMS) היה בשימוש נרחב בלימוד התגובות של תאים לגירוי חשמלי. עם זאת, בניגוד לרב נדרשו כדי להמציא מכשיר PDMS צעדים, הבנייה הפשוטה ומהירה של מייקר אקריליק fl שבב uidic הופכת אותו מתאימה לשני אב טיפוס המכשיר וייצור. עם זאת, אף אחד מהמכשירים דיווחו להקל על המחקר יעיל של חומר כימי בו זמנית וDCEהשפעות F על תאים. בדו"ח זה, אנו מתארים העיצוב והייצור של שבב רב-ערוצי מבוססי אקריליק חשמלי-שדה-כפול (MDF) כדי לחקור את ההשפעה הזמנית של כימי וגירוי חשמלי על תאי סרטן הריאות שלנו. שבב MDF מספק שמונה שילובים של גירויים חשמליים / כימיים בבדיקה אחת. השבב לא רק מקצר מאוד את זמן הניסוי הנדרש, אלא גם מגביר את הדיוק בelectrotaxis לימודים.
Introduction
התנהגותם של תאים חסיד נעו לעבר אנודה או קתודה תחת שדה חשמלי הנוכחי ישיר (dcEF) נקראת electrotaxis. התנהגות electrotactic של תאים ממלאים תפקיד משמעותי בעובר, התחדשות של עצבים, וריפוי פצע. תאי גידול 1 כגון תאי ערמונית עכברוש סרטן, תאי סרטן שד 2, 3 וריאות תאי אדנוקרצינומה 4-8 הראו תנועת electrotactic תחת dcEF מיושם . EF הפיזיולוגי כבר נמדד ברקמות בלוטה. 9,10 Electrotaxis דווח גם בתאים סרטניים הקשורים בלוטה. 2,3 יחדיו, electrotaxis של תאי הסרטן נחשב לגורם גרורות. 11 שליטה ההדרכה החשמלית של תאים סרטניים תחת dcEF עשויים להיות גישה פוטנציאלית לטיפול העתידי בסרטן. עם זאת, היום, המנגנון המולקולרי מפורט של electrotaxis נותר שנוי במחלוקת. לכן, חקירה של INFluence של גירוי חשמלי על נדידת תאי הסרטן יכול להקל על פיתוח אסטרטגיות לטיפול בסרטן.
לאחרונה, מכשירי יו-microfluidic כבר מפוברקים ללימוד תגובות הסלולר לזרום כוח גזירה, 12 מילויים כימיים, 13 ו חשמל גירויים 4 במבחנה. הייצור של מכשירים ביו-microfluidic באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS) או polymethylmethacrylate (PMMA, הידוע גם באקריליק) צמצם בהצלחה שיעור הכישלון של ניסויים כאלה. יתרה מזאת, שימוש בהתקני מייקרו-נוזליים מבוסס אקריליק כמו אב טיפוס לחקירת נושאים ביולוגיים הוא פשוט יותר מאשר באמצעות שבבי PDMS. תפקידים שונים במכשירים מבוססי אקריליק פותחו עבור electrotaxis מחקר. עם זאת, אף אחד מהעיצובים הקודמים יכול לבדוק בו זמנית ההשפעות של תנאים כימיים שונים ושדה החשמלי על תאים לelectrotaxis מחקר. לפיכך, פיתחנו מכשיר-mu microfluidicltichannel כפול חשמלי-שדה (MDF) ארבעה ערוצי תרבות עצמאיים ושמונה תנאי ניסוי שונים בשבב אחד המכיל שבב.
שבב MDF מבוסס אקריליק, דווח לראשונה על ידי הו et al., 8 משלב גירוי חשמלי וכמה ערוצים מבודדים כימי. ערוצים מבודדים כימי אלה יכולים לשמש לתרבות סוגים שונים של תאים בניסוי אחד. DcEF בערוצים מופק על ידי אספקת חשמל. שני שדות חשמליים עצמאיים, אחד עם כוח שימושי חשמלי-שדה (EFS) ועוד עם 0 EFS, נערכים בכל ערוץ כימי מבודד. בדרך זו, השבב מספק EF coexisting שליטה טובה יותר וגירוי כימי. יתר על כן, תוצאות מהסימולציה נומרית של דיפוזיה הכימית בתוך שבב MDF מצביעות על כך שאין זיהום לחצות אירע בין הערוצים לאחר תקופת ניסוי 24 שעות. 8
לעומת דוויCE דווח על ידי Li et al., 14 השבב MDF מספק אזור תרבות גדול יותר, המאפשר לאנליזה ביוכימית נוספת של תאי גירוי חשמלי. בנוסף, עם אזור התצפית הגדול יותר של שבב MDF, ניתן לצפות יותר תאים במבחן, כך הניתוח של מהירות הגירה או הכוונה של תאי מגורה חשמלי הוא מדויק יותר. עיצובי השבב בודדים הערוצים של מחקרים קודמים שדווחו על ידי הואנג et al. 4 וצאי et al. 15 מאפשרים רק סוג אחד של תא או כימי להיבדק. עם זאת, שבב MDF יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של כימיקלים שונים על electrotaxis, כמו גם את ההשפעות של גירוי חשמלי בסוגים שונים של תאים. במילים אחרות, שבב MDF מאפשר מחקר יעיל של תלות מינון כימית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מצאנו את התהליך של הקפדה מתאמי אקריליק על שכבת 1 של שבב MDF להיות מסובך. היישום של רק 1 עד 2 μl של דבק סופר מספיק כדי לדבוק בנחישות את המתאם על שבב MDF. כמויות גדולות יותר של דבק הביאו פילמור שלם של הדבק ואי לדבוק סופר. ברגע שמתאמי אקריליק דבקו בחוזקה על שבב MDF, דליפת נוזל במער?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24×60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| Teflon tube | HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan | UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING | outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scientific |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| indium tin oxide glass (ITO glass) | AimCore Technology Co., Ltd | TN/STN, ≦10Ω | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
Referências
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Hsu, W. -. C., Jhang, J. -. H., Young, T. -. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
