Ao enxertar grânulos embebidos em fatores de crescimento ou inibidores específicos de vias de sinalização em embriões em desenvolvimento, é possível testar diretamente seus efeitos in vivo. Neste protocolo, grânulos são enxertados no broto do membro para determinar os efeitos dessas moléculas na expressão gênica e na transdução de sinal.
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Artigo de método
Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression
Neste artigo
Resumo
Resumo
Usando embriões de galinha, é possível testar directamente os efeitos de ambos os factores de crescimento específicos ou inibidores das vias de sinalização sobre a expressão do gene e a activação das vias de transdução de sinal. Esta técnica permite a entrega de moléculas de sinalização em estágios de desenvolvimento definidos com precisão para horários específicos. Após esta embriões podem ser colhidas e a expressão de genes examinados, por exemplo, por hibridação in situ, ou a activação de vias de transdução do sinal observado com a imunocoloração.
Neste contas de heparina vídeo embebido em FGF18 ou grânulos AG 1-X2 embebidas em U0126, um inibidor MEK, são enxertados no botão do membro in ovo. Isto mostra que induz a expressão de FGF18 MyoD e fosforilação de ERK e tanto endógena e FGF18 induzida MyoD expressão é inibida por U0126. Grânulos embebidos em um antagonista do ácido retinóico pode potenciar a indução precoce MyoD por FGF18.
Esta abordagem pode ser-nosed com uma vasta gama de diferentes factores de crescimento e inibidores e é facilmente adaptado a outros tecidos no embrião em desenvolvimento.
Introdução
Embriões de aves forneceram uma ferramenta poderosa para o estudo do desenvolvimento de muitos anos 1. Uma das suas características mais útil é que eles são relativamente fáceis de manipular. Desenvolvimento externo faz com que seja possível abrir o ovo para aceder ao embrião e executar várias micromanipulations incluindo exemplos, tais como o sistema de quimera de codorniz-do pintainho clássica para o estudo de 2,3 destino celular, a injecção de retrovirus para a sobre-expressão em tecidos específicos durante o desenvolvimento 4,5 e cultura explante para identificar fontes de sinalização de desenvolvimento 6. Mais recentem....
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Protocolo
Declaração de Ética: Todas estas experiências seguem o cuidado com os animais e as diretrizes éticas da Universidade de Nottingham.
1. Preparação de heparina Beads para enxertia
- Lave cuidadosamente contas de heparina em PBS antes da utilização. Nota: contas podem ser armazenadas a 4 ° C como uma suspensão em PBS.
- Seleccionar os grânulos para enxerto, removendo-os do estoque com uma pipeta de 20 uL a uma queda de 1 ml de PBS. Em seguida, usar uma micropipeta ajustado para 2 ul de transferência de contas em uma gota de 20 ul de PBS numa placa de petri de 3 cm. Escolha grânulos com base no tamanho e, usan....
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Resultados
Na fase HH 21 MyoD não é expresso em mioblastos em desenvolvimento de membros embora coloração pode ser visto na miótomo dos somitos em desenvolvimento (Figura 1A). A Figura 1B mostra a hibridização in situ para MyoD 6 horas no seguimento de um enxerto FGF18 grânulo. MyoD é induzida em mioblastos perto do rebordo, enquanto não há expressão no membro contralateral. Co-enxerto de um grânulo embebido em U0126, um inibidor específico da MEK, a indução de blocos FGF18 MyoD (.......
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Discussão
A utilização de enxertos de talão aplicados directamente para o desenvolvimento de tecidos in ovo é uma ferramenta poderosa para dissecar o papel do crescimento factor de sinalização durante o desenvolvimento dando controlo sem paralelo através da fase de desenvolvimento em que elas são aplicados e a duração da exposição.
A escolha de grânulo para cada tipo de molécula é importante. Pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como os inibidores aqui descritos e ácido retinóico, geralmente liga bem.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente financiado por um prêmio de início de carreira da Universidade de Nottingham para DS. O RM é financiado pelo Comitê Superior para o Desenvolvimento da Educação do Iraque.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Contas de acrílico de heparina | Sigma | H5263 | As contas de acrílico-heparina usadas foram descontinuadas. No entanto, um produto de substituição está disponível, contas de agarose de heparina, cat no H6508. Estes são transparentes, então mais difíceis de trabalhar, mas podem ser manchados com vermelho de fenol da mesma maneira que as contas AG 1-X2, |
| contas AG 1-X2 | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Contas azuis Affi Gel | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | Estas contas têm sido usadas com uma variedade de fatores de crescimento, incluindo Shh e FGFs e podem ser usadas para substituir contas de heparina |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Ressuspenda em PBS com 0/1% de BSA, prepare alíquotas de uso único de 0,5-1ul e armazene a -80 ° C. Os lotes e os fornecedores podem variar, portanto, diferentes concentrações devem ser testadas para determinar uma dose eficaz. |
| U0126 | Sinalização | 9903 | Faça um estoque de 20mM em DMSO e armazene alíquotas de uso único a -80 graus Celsius. Proteger da luz. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Ressuspenda em DMSO e armazene em alíquotas de uso único a -80 graus Celsius. Proteja da luz. |
| Tinta da China preta | Windsor e Newton | 5012572003384 (30 ml) | Embora alternativas a este produto estejam disponíveis, deve-se tomar cuidado, pois algumas tintas são tóxicas para embriões |
| Fio de tungstênio, 0,1 mm de diâmetro. 99,95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicilina / estreptomicina | Sigma | P0781 | Diluir 100X em PBS / tinta e PBS / FCS |
Referências
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (....
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Reimpressões e permissões
