유전자 발현에 영향을 미치는 신호 전달 진학을 확인하기 위해 닭 배아 사지 개발에 구슬의 접목
Summary
By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.
Abstract
닭 배아를 사용하여 직접 성장 인자 또는 유전자 발현 및 신호 전달 경로의 활성화에 대한 신호 경로의 어느 특정 억제제의 효과를 테스트 할 수있다. 이 기술은 특정 시간에 대한 정확한 정의 발달 단계에서 신호 전달 분자의 전달을 허용한다. 이 배아 수확 및 유전자 발현 원위치 혼성화, 또는 면역 염색으로 관찰 신호 전달 경로의 활성화에 의해, 예를 들어, 검사 될 수 후.
U0126, MEK 억제제에 적신이 FGF18에 배어 비디오 헤파린 구슬 또는 AG 1-X2 구슬, OVO에서 사지 꽃 봉오리에 이식된다. 이 FGF18가 U0126에 의해 억제된다 MyoD 및 ERK의 인산화 및 내인성 및 FGF18 유도 모두 MyoD 발현의 발현을 유도 것을 보여줍니다. 레티노 산 길항제에 배어 구슬은 FGF18에 의해 조기 MyoD 유도를 강화시킬 수 있습니다.
이러한 접근 방식은 우리가 될 수 있습니다다른 성장 인자 및 억제제와의 광범위한 혼성 쉽게 배아에서 다른 조직으로 구성된다.
Introduction
조류 배아는 몇 년 1 개발의 연구를위한 강력한 도구를 제공하고 있습니다. 가장 유용한 특징 중 하나는 상대적으로 쉽게 조작 할 수 있다는 것이다. 외부 개발은 세포의 운명 2,3- 연구를위한 고전 메추라기 병아리 키메라 시스템과 같은 예를 포함하여 다양한 micromanipulations를 배아 액세스하는 달걀을 열고 수행하는 것을 가능하게 개발 4,5- 동안 특정 조직에서 과발현을위한 레트로 바이러스의 주입 및 이식편 문화는 발달 신호 소스 (6)를 식별합니다. 최근에 GFP를 발현하는 형질 전환 닭 줄에서 이식과 레이블이없는 호스트 사이에 발생하는 키메라 고전 이식 및 유전자 변형의 조합이 개발 7,8에 중요한 통찰력을 제공 할 수있는 것으로 나타났습니다.
조류 배아 조작 될 수있는 용이성을 사지 공부 그것을 우수한 모델을 만들었다개발 9. 생체 현상 사지 특정 성장 인자의 적용은 사지 10,11 패터닝을 변경하고이 프로세스 (12)에 대한 통찰력을 제공하고 요소를 식별하는 수단이되고있다. 이 접근법은 또한 근육 발달을 조절하는 인자를 연구하는 데 사용되었으며, 이러한 Wnts 13, 14, BMPs에 HGF (15) 같은 다양한 신호들에 대한 역할을 밝혀냈다.
최근 이러한 기술은 사지 싹 근육 조직의 유전자 발현을 제어하는 신호를 조사하기 위해 사용되었으며, FGF18 및 레티노 산 사이의 상호 작용이 MyoD 식 (16)의 타이밍을 제어 할 수 있음을 보여 주었다. 비드 상에 로딩하고 정의 발달 단계에서 특이 조직에 직접 그래프트 될 수 성장 인자 및 작은 분자의 조합을 이용하여 개발 중에 거의 모든 시간과 지역을 개입 할 수있는 기회를 제공한다. 이것은 INVE하는데 사용 된체절 패터닝 17, 18, 신경 사양 (19), 신경 크레스트 마이그레이션 (20)과 축 연장 (21)를 포함하여 많은 프로세스를 stigate.
여기에서 우리는 닭 사지 개발에 중 성장 인자 또는 억제제에 배어 구슬을 접목하는 방법을 설명합니다. 이것은 계내 혼성화에 근육과 특정 유전자의 발현을 분석하여 이들 신호 근육 생성에 미치는 영향을 결정하기 위해 사용되어왔다. 우리는 레티노 산 또는 특정 신호 전달 경로의 소분자 저해제로서 작은 소수성 분자에 대한 성장 인자, 또는 AG 1-X2 구슬에 사용되는 헤파린 침지 비드를 사용하여 이식 조직을 설명한다. 그러나 다른 구슬도 FGFs (22)과 쉬 (23)을 모두 전달하는 데 사용 된 어떤 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
오보에서 조직 개발에 직접 적용 비드 이식편의 사용은 그들이 적용되는 발달 단계 및 노출 기간에 걸쳐 탁월한 제어를주는 개발 중에 성장 인자 신호 전달의 역할을 해부 강력한 도구이다.
분자의 각 유형에 대한 비드의 선택은 중요하다. 그것은 각각 실험적 이들 비드에 억제제의 효과를 시험 할 필요가 있지만, 여기에 설명 된 이러한 억제제 및 레티노 산 작은 소수성 분?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.
Materials
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
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