遺伝子発現に影響を​​及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト

Summary

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Abstract

ニワトリ胚を使用して直接成長因子または遺伝子発現およびシグナル伝達経路の活性化におけるシグナル伝達経路の特異的阻害剤のいずれかの効果を試験することが可能です。この技術は、特定の時間に正確に定義された発達段階でのシグナル伝達分子の送達を可能にします。この胚を採取し、遺伝子発現は 、in situハイブリダイゼーション、または免疫染色で観察されたシグナル伝達経路の活性化により、例えば、検査することができる後。

U0126、MEK阻害剤に浸し、このFGF18に浸したビデオヘパリンビーズ、AG 1-X2ビーズでは、 卵内肢芽に移植されています。これは、FGF18はMyoDの及びERKのリン酸化の発現を誘導し、誘導された内因性の両方、およびFGF18のMyoD発現がU0126により阻害されることを示しています。レチノイン酸アンタゴニストに浸したビーズは、FGF18によって時期尚早のMyoDの誘導を増強することができます。

このアプローチは、私たちすることができます異なる増殖因子および阻害剤の広い範囲で編、容易に胚内の他の組織に適合されます。

Introduction

鳥類胚は長年¹の開発のための研究のための強力なツールを提供してきました。彼らの最も有用な特徴の1つは、操作が比較的容易であるということです。外部開発は、このような細胞の運命^{2,3を研究するための}古典的なウズラ-ニワトリキメラシステムなどの例を含む様々なmicromanipulationsを胚にアクセスするために卵を開き、実行することが可能となり、開発^4,5の間に特定の組織における過剰発現のためのレトロウイルスの注入発達シグナル源^6を識別し、移植片培養。さらに最近では、GFPを発現するトランスジェニックニワトリのラインからの移植片とラベルなしホストとの間で発生するキメラは、古典的な移植や遺伝子修飾の組み合わせが開発^7,8に重要な洞察を提供することができることを示しています。

鳥類胚を操作することができる容易さはそれを手足を研究するための優れたモデルをしました開発^9。 in vivoでの開発手足に特定の成長因子の適用は、四肢のパターニング^{10,11を変化させ、}このプロセス¹²への洞察を提供し続け因子を同定してきました。このアプローチはまた、筋肉の発達を調節する因子を研究するために使用されており、そのようなのWnt ^13、BMPは¹⁴およびHGF ¹⁵などの多数の信号のための役割を明らかにしました。

最近、この技術は、肢芽に筋原性遺伝子発現を制御する信号を調査するために使用されており、FGF18とレチノイン酸との間の相互作用は、MyoDの発現¹⁶のタイミングを制御することができることを示しています。ビーズ上にロードした後、定義された発達段階で特定の組織に直接移植することができる成長因子および小分子の組み合わせを使用することで、開発中のほぼすべての時間と領域に介入する機会を与えてくれます。これはinveするために使用されています体節のパターニング^17,18、神経仕様^19、神経堤の移行²⁰と軸^延長部21を含む多くのプロセスをstigate。

ここでは、鶏の手足の開発に増殖因子または阻害剤のいずれかに浸したビーズを移植する方法について説明します。これは、in situハイブリダイゼーションと筋特異的遺伝子発現を分析することによって筋形成におけるこれらの信号の影響を決定するために使用されてきました。我々は、レチノイン酸または特定のシグナル伝達経路の小分子阻害剤のような小さな疎水性分子のための成長因子、またはAG 1-X2ビーズのために使用されるヘパリン浸したビーズのいずれかを使用して移植片を記載しています。しかし、他のビーズは^、22のFGFおよびShhの²³の両方を提供するために使用されているにもご利用いただけます。

Protocol

倫理の声明：すべてのこれらの実験は、動物のケアとノッティンガム大学の倫理指針に従ってください。 移植のためのヘパリンビーズの作製使用前に徹底的にPBSにヘパリンビーズを洗ってください。注：ビーズをPBS中のスラリーとして4℃で保存することができます。 1mlのPBSのドロップに20μlのピペットを用いてストックからそれらを除去する…

Representative Results

HHステージでは21のMyoDは染色が開発体節（ 図1A）の筋節に見ることができるが、四肢の筋芽細胞の開発に表現されていない。 図1Bは、FGF18ビーズ移植以下のMyoD 6時間in situハイブリダイゼーションを示しています。対側肢では発現がないながらのMyoDは、ビーズの近くに筋芽細胞に誘導されます。 U0126、MEK、のMyoD（ 図1C）のブロックのFGF18誘導の特異…

Discussion

卵内の組織の開発に直接適用ビーズ移植片の使用は、それらが適用されるときの発達段階と暴露時間を超える圧倒的な制御を与え、開​​発中の増殖因子シグナル伝達の役割を分析するための強力なツールです。

分子の各タイプのビーズの選択は重要です。それは、経験的にこれらのビーズのそれぞれの阻害剤の有効性をテストする必要があるが、このようなここに記?…

Materials

Heparin acrylic beads	Sigma	H5263	The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blue beads	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18	Peprotech	100-28	Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126	Cell Signalling	9903	Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink	Windsor and Newton	5012572003384 (30ml)	While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95%	Alfa Aesar	10404
Penicillin / streptomycin	Sigma	P0781	Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS