Прививка шариков в развивающихся куриных эмбрионов Конечности выявлять пути передачи сигналов, влияющие экспрессии генов
Summary
By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.
Abstract
Использование куриных эмбрионов можно проверить непосредственно эффектами или факторы роста или специфических ингибиторов пути на экспрессию генов и активацией пути передачи сигналов сигнализации. Этот метод позволяет доставку сигнальных молекул на четко определенных этапах развития для конкретных времен. После этого эмбрионы могут быть собраны и изучены экспрессия гена, например, путем гибридизация, или активации путей передачи сигнала с использованием иммунной наблюдаемых.
В этом видео гепарин бисера, пропитанных FGF18 или AG 1-X2 бисера, пропитанных U0126, ингибитора MEK, привиты в зачатках конечностей в яйце. Это показывает, что FGF18 индуцирует экспрессию MyoD и ЭРК фосфорилирования и как эндогенного и FGF18 индуцированной экспрессии MyoD подавляется U0126. Бусы, пропитанные антагониста ретиноевой кислоты может потенцировать индукцию преждевременное MyoD по FGF18.
Этот подход может быть намиред с широким спектром различных факторов роста и ингибиторов и легко адаптировать для других тканей в развивающегося эмбриона.
Introduction
Эмбрионов птиц обеспечили мощный инструмент для изучения развития в течение многих лет 1. Один из их самых полезных характеристик является то, что они относительно легко манипулировать. Внешний разработка позволяет открыть яйцо открыть зародыш и выполнять различные микроманипуляций в том числе такие примеры, как классического перепела-цыпленок химера системы для изучения клеток судьбу 2,3, инъекции ретровирусов для избыточной экспрессии в определенных тканях в ходе развития 4,5 и эксплантов культуры, чтобы определить источники развития сигнализации 6. Совсем недавно химер возникает между немеченых хозяев с трансплантатами из трансгенной линии, экспрессирующей куриного GFP показал, что сочетание классической прививки и генетической модификации может обеспечить важную информацию в развитие 7,8.
Легкость, с которой птичий эмбрион можно манипулировать сделал его отличным модель для изучения конечностьразвитие 9. Применение специфических факторов роста для развивающихся конечностей в естественных условиях играет важную роль в выявлении факторов, которые изменяют паттерна конечностей 10,11 и продолжает оказывать понимание этого процесса 12. Этот подход был также использован для изучения факторов, которые регулируют развитие мышц и обнаружили роли для многочисленных сигналов, таких как Wnts 13 БМП и 14 HGF 15.
В последнее время эта техника была использована для исследования сигналов, контролирующих экспрессию генов в миогенную почки конечности и показал, что взаимодействие между FGF18 и ретиноевой кислоты может контролировать сроки MyoD выражения 16. Используя комбинацию факторов роста и малых молекул, которые могут быть загружены на бусы, а затем непосредственно в привитых определенных тканях в определенных стадиях развития дает возможность вмешаться в практически в любое время и регион в процессе развития. Это была использована для INVEstigate многие процессы, включая сомитов паттерна 17,18, нервной спецификации 19 нервного гребня миграции 20 и расширение 21 оси.
Здесь мы опишем метод пересадки шарики, смоченные в либо факторов роста или ингибиторов в развитии куриные конечности. Это было использовано, чтобы определить влияние этих сигналов на миогенеза путем анализа экспрессии конкретного гена мышечной с в гибридизация. Опишем трансплантатов с использованием либо гепарином, пропитанной шарики, которые используются для факторов роста, или AG 1-Х2, бусы для малых гидрофобных молекул, таких как ретиноевая кислота или низкомолекулярные ингибиторы специфических сигнальных путей. Однако другие шарики, также доступны, которые были использованы для доставки как FGFs 22 и 23 Shh.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование бортовых трансплантатов, применяемых непосредственно к разработке тканей в яйце является мощным инструментом для анализировать роль сигнализации фактора роста во время развития дает беспрецедентный контроль над стадии развития, на которой они применяются и продолжит…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.
Materials
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
Referências
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Bell, E., Brickell, P. Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo. Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).
- Abu-Elmagd, M., et al. Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis. Biologia do Desenvolvimento. 337, 211-219 (2010).
- Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite. Development. 121, 651-660 (1995).
- McGrew, M. J., et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).
- Valasek, P., et al. Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle. Biologia do Desenvolvimento. 357, 108-116 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
- Rosello-Diez, A., Torres, M. Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells. Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).
- Anakwe, K., et al. Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing. Development. 130, 3503-3514 (2003).
- Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. The importance of timing differentiation during limb muscle development. Current Biology. 8, 642-652 (1998).
- Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo. Biologia do Desenvolvimento. 179, 303-308 (1996).
- Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts. Biologia do Desenvolvimento. 396, 214-223 (2014).
- Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5. Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).
- Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals. Development. 127, 4105-4113 (2000).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Martinez-Morales, P. L., et al. FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk. Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).
- Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension. Development. 134, 2125-2135 (2007).
- Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity. Development. 125, 2825-2835 (1998).
- Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes. Development. 125, 777-790 (1998).
- Sweetman, D., et al. FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos. Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).
- Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals. BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).
- Scott, B. B., Lois, C. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).
- Seidl, A. H., et al. Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).
