Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em> Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em> Pathosystem
Summary
Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.
Abstract
Özel bir mobil bağışıklık hücrelerinin yokluğunda, bitkiler lokalize programlanmış hücre ölümü ve Sisteme Etki Eden Kazanılmış Direnç patojen saldırısına karşı kendilerini savunmak için kullanmaktadır. Genel bitki bağışıklık tepkisinin belirli bir Arabidopsis geni katkısı spesifik olarak ve kantitatif olarak enfekte olmuş doku içinde patojen büyümesinin tahlil ile değerlendirilebilir. Üç yılı aşkın süredir, hemibiotrophic bakteri Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (Psm ES4326) yaygın Arabidopsis bağışıklık tepkisini altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için bir model patojen olarak uygulanmıştır. Yaprak dokusuna patojenleri teslim etmek, birden fazla aşılama yöntemleri kurulmuştur, örneğin, şırınga sızma, daldırma aşılama, sprey, vakum infiltrasyon ve sel aşılama. Aşağıdaki protokol yetişkin yaprakları içine zehirli Psm ES4326 sunmak için optimize edilmiş bir şırınga sızma yöntem açıklanırArabidopsis bitkileri, toprak yetiştirilen ve doğru bu patojenin yönelik artan hastalık yatkınlık (EDS) için ekran. Buna ek olarak, bu protokol daha Salisilik Asit (SA) -Triggered Bağışıklık (STI) ve MAMP-Tetikledi Bağışıklık (MTI) dahil bitki savunma farklı katmanları, içinde belirli bağışıklık kusurları incelemek için birden fazla ön tedaviler ile takviye edilebilir.
Introduction
Nedeniyle sapsız doğası, bitkiler sürekli çeşitli yaşam tarzları ve beslenme stratejileri 1 sergileyen patojenlerin bir bolluk tarafından tehdit edilmektedir. Nekrotrofik patojenler aktif gizli toksinler ve enzimler konak dokusunu öldürmek ve ölü hücreleri 1 beslemek için ise bir ilk yaklaşım için, biotrophic patojenler, besin almak için hayatta onların ev sahibi korumak. Patojenler olarak adlandırılan hemibiotrophs başka bir grup, patojen birikimi 2 belli bir eşik ulaştıktan sonra nekrotrofik sahneye biotrophic sahne ve vardiya ile enfeksiyon kursu başlıyor. Etkili bu mikroorganizmalara karşı kendilerini savunmak amacıyla, bitkiler patojen saldırı tespit ve tetiklemek için birden fazla gözetim mekanizmaları ile donatılmış karmaşık bir doğal bağışıklık sistemini geliştirmişlerdir hücre ölümünü 3 yanı sıra Sistemik Kazanılmış Direnç (SAR) 4 programlanmış lokalize. Mevcut araştırma temel sig karakterize odaklanmıştırnaling bileşenleri ve bitki bağışıklık sistemi 5 içinde çapraz görüşmeler.
"Zik-zak" modeli 5 önerildiği gibi, bitki doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin birinci tabaka bir mikrop istilasına tespit etmek için, plazma membran lokalize bir görüntü tanıma Reseptörler (PRR) varlığını gerektirir. PRR'ler Mikrop İlişkili Moleküler Desenler (MAMPs) tanımak ve MAMP-Tetikledi Dokunulmazlık (MTI) 6 kurabiliyoruz. Antimikrobiyal PR proteinleri 7 kodlayan genlerin transkripsiyonel bir regülasyonunu indükleyici yanı sıra, MTI hücre duvarına reaktif oksijen türlerinin üretimi (ROS) ve reaktif nitrojen (RNS), kaloz birikimini içeren patojen büyümesini tutuklama etkinlikleri çeşitli yol açar yanı sıra birden fazla kinaz sinyal aktivasyonu 8 yolaklarıyla olarak.
Şimdiye kadar, çok sayıda bakteriyel MAMPs flg22 9 da dahil olmak üzere, Arabidopsis'te MTI tetiklemek için tespit edilmiştir </sup> (Flagellin türetilen bir 22 amino asit fragmanı) ve yapısal hücre duvarı bileşeni elf18 10 (bakteriyel için uzatma faktörü Tu 18 amino asit), 11 peptidoglikanlar. Başarılı bir enfeksiyon kurmak için, bazı özel patojenler, hücre içi veya hücreler arası boşluklar içine gizli virülans efektör proteinleri yeteneği gelişti ve dolayısıyla MTI bastırmak ve Efektör-Tetikledi Hassasiyetinin (ETS) 12,13 tetikleyebilir var. Örneğin, hastalık oluşturma efektörler enfekte olmuş doku 14-16 içinde hastalık gelişimini azaltmak için TEB Mitojen Aktive Protein Kinaz (MAPK) fosforilasyon kaskadlar etkisiz hale getirebilir. Host ve patojen arasındaki dinamik işbirliği evrimi sırasında, bitkiler de efektör proteinleri tanır ve patojen hastalık oluşturma 17 molekülleri azaltmak için kontra strateji geliştirmiştir. Bu, doğrudan veya dolaylı efektör tanıma hastalık direnci (R) proteinleri 18 aracılık eder. T çoğuetek NB-LRG üyeleri (nükleotid Bağlama ve Lösin Zengin Tekrarlar) ailesi 19 vardır. R proteini tarafından avirulent efektör algısı Efektör-Tetikledi Bağışıklık (ETİ) 20 olarak karakterize güçlü ve daha geniş bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır. Savunma genlerinin 21 ekspresyonunu ve savunma metabolitlerinin 22 üretimini indükleyen yanı sıra, ETİ genellikle komşu doku 3 içine yayılmasını kısıtlamak için patojen Hiperduyarlı Cevap (HR) olarak bilinen bir hızla lokalize programlı hücre ölümüne yol açar.
Programlanmış lokalize hücre ölümü 23 ek olarak, bitkileri (SAR) 4 Sisteme Etki Eden Kazanılmış Direnç olarak adlandırılan uzun süreli ve sistem genelinde bir bağışıklık tepkisi başlatılması yeteneğine sahiptir. Bir biotrophic patojen ile tehditten sonra, bitki hücreleri, lokal ve sistemik dokularda 24 hem de endojen fitohormon salisilik asit (SA) ve PR proteinlerinin sentezini ve birikimini tetikler. T yoluylaHer ne kadar süreç, hazırlık yüksek bir durumu patojenlerin 24, geniş bir spektrum ile daha sonraki bir enfeksiyona karşı savunma davranışlarını sırasında daha hızlı bir montaj sağlar enfekte edilmemiş yaprak elde edilir. SA ve örneğin benzo gibi sentetik analogları (1,2,3) tiadiazol-7-karbotioik asit S-metil ester (BTH) ve 2,6-dikloroizonikotinik asit (INA) kimyasal Salisilik asit uyarabildiğinden (SA) dış uygulama 24 üzerine -Triggered Bağışıklık (STI). Patojenesis-ilgili genler 1 (NPR1) arasında Nonexpressor lokal ve sistemik dokularda 21,25,26 hem de SA aracılı savunma cevabı sırasında büyük bir kopyalama düzenleyicisi SA reseptörleri ve işlevlerinden biri olarak kabul edilmektedir. Bu kesin NPR1 SAR kurulması için gerekli olan ve NPR1 kaybı, Pseudomonas syringae'ye 25 doğru dramatik bir duyarlılığa yol açtığı gösterilmiştir.
Yoğun bitki moleküler katkı karakterize etmek içinbitki-patojen etkileşimlerine bileşenleri, çok sayıda biyo-deneyler, ROS 27 patlama da dahil olmak üzere, belirli bir savunma etkinlikleri ölçmek için protein ürünlerinin 21 kaloz birikimi 28 savunma genleri ekspresyonunu ve birikimini geliştirilmiştir. Bu bireysel deneyler bitki bağışıklık tepkisinin özel bir forma anlayış sağlamak mümkün olmakla birlikte, bunların hiçbiri, ancak, tüm tesis düzeyinde tam bir savunma yanıtı temsil edebiliyoruz. Bunun aksine, enfeksiyondan sonraki patojen büyümesinin miktar organizma seviyesinde bağışıklık tepkisinin genel bir tahmin sağlar. Bu nedenle, kesin ve son derece standart patojen aşılama testinin geliştirilmesi ve optimizasyonu Arabidopsis bağışıklık tepkiler üzerine araştırma ve keşifler kadar yakıt için kritik öneme sahiptir.
Pseudomonas syringae, bir Gram negatif bir bakteridir, Arabidops da dahil olmak üzere bitki hücrelerine bir dizi hastalığa neden olabilen bir fitopatojenin olarak tanımlandı29 olduğunu. P. – Model bitki-patojen sistemi, Arabidopsis gibi syringae etkileşim yaygın moleküler mekanizmaları altında yatan bitki savunma yanıtları 29 anlamak için uygulanmıştır. Şimdiye kadar, üzerinde 50 P. Syringae pathovars farklı bitki türlerinin 30 bulaştırmak için kendi yeteneklerine göre tespit edilmiştir . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) 31 ve P. syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) 32 iki en yaygın olarak kullanılan ve yaygın karakterize öldürücü suşlar vardır. Kenara bitki tarafından tanınan ve MTI yanıtı tetikleyen olmaktan, Pst DC3000 ve Psm ES4326 MTI bastırmak ve patojen büyüme 31,33 lehine ETS tetiklemek için öldürücü efektör proteinleri salgılayan yeteneğine sahiptirler.
Işlevsel Arabidopsis ve P. etkileşimini incelemek syringae, çoklu0; patojen enfeksiyon yöntemleri patojen teslim yaklaşımına dayalı geliştirilmiştir. Toprak yetiştirilen bitkiler için patojen şırınga infiltrasyonu, vakum infiltrasyonu, daldırma aşılama ve sprey aşılamadan 29,34 ile teslim edilebilir. Son zamanlarda, fide sel aşılama tahlil doku kültürü üzerinde büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için geliştirilen genç Arabidopsis bitkiler 35 plakaları yetiştirilen. Şırınga sızma, en sık kullanılan yaklaşım olarak, elle stoma 29 olarak adlandırılan doğal yaprak deliklerden apoplast içine patojeni sunar. P. Bu yaklaşım sayesinde, eşit miktarlarda syringae enfekte kanadı içine sızabilir ve bitki bağışıklık tepkisinin gücü ters patojen artışı seviyeleri ile bağıntılıdır. Bu nedenle, patojen büyümesinin ölçümü bütün bitki düzeyinde bağışıklık fonksiyonunu değerlendirmek için en uygun yaklaşım olarak hizmet vermektedir. Buna ek olarak, şırınga infiltrasyonu lokal ve sistemik doku ayırt edebilirsiniz, hangi olabilir bSAR 36 altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize uygulanabilir e.
Aşağıdaki protokol, artan hastalık yatkınlık (EDS) için Arabidopsis mutantlar ekrana Psm ES4326 ile optimize edilmiş şırınga sızma testi açıklar. Bu protokol, iki Arabidopsis genotipleri istihdam sağlayacak: vahşi tip ekotipinin Columbia-0 (Col-0) bitkileri (kontrol) ve npr1-1 kayıp fonksiyon-mutantlar (hypersusceptible) Bu öldürücü bakteri suşu Psm ES4326 37 ile enfekte olacaktır. Npr1-1 mutant tirozin son derece korunmuş histidin değiştirir ve 25 fonksiyonel olmayan protein işler NPR1 molekülünün ankirin-tekrar konsensüs dizisi içinde bir nokta mutasyonu taşır. Buna ek olarak, şırınga süzme analizinde modifikasyonları bir dizi MTI ve STI da dahil olmak üzere bağışıklık tepkisi, spesifik tabakalar kusurların kantifikasyonuna izin veren bu tarif edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nüfusu mevcut arazileri azalan ve artan dünyada araştırmacılar ekin iyileştirilmesi için acil ihtiyaçları zorlanmaktadır. Verim büyük ölçüde çeşitli biyotik ve abiyotik streslere etkilenebilir. Bunlar arasında, patojen enfeksiyonu tek başına 45 ABD'de yaklaşık% 12 kayıp sorumlu mahsul verim azalmasına önde gelen nedenlerinden biridir. Bu sorunu gidermek için, masif araştırma modeli Arabidopsis'de yapılmıştır – P. syringae pathosystem kapsamlı bileşenleri ve b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.
Materials
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12×6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11×21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11×21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity – direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses – the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
