Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il<em> Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em> Patosistema
Summary
Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.
Abstract
In assenza di cellule immunitarie specializzate mobili, piante utilizzano il loro localizzata morte cellulare programmata e Sistemica resistenza acquisita per difendersi contro l'attacco patogeno. Il contributo di uno specifico gene Arabidopsis per la risposta immunitaria impianto complessivo può essere specifico e quantitativamente valutata analizzando la crescita dei patogeni all'interno del tessuto infetto. Per oltre tre decenni, il batterio Pseudomonas syringae pv hemibiotrophic. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) è stato ampiamente applicato come modello patogeno per studiare i meccanismi molecolari alla base della risposta immunitaria Arabidopsis. Per offrire patogeni nel tessuto foglia, sono stabilite diversi metodi di inoculazione, ad esempio, la siringa infiltrazione, tuffo inoculazione, spray, infiltrazione vuoto e inondazioni inoculazione. Il protocollo che segue descrive un metodo siringa infiltrazione ottimizzato per fornire virulenta Psm ES4326 in foglie di adultisuolo coltivato piante di Arabidopsis e schermo per una migliore precisione predisposizione alle malattie (EDS) nei confronti di questo patogeno. Inoltre, questo protocollo può essere integrato con più pre-trattamenti per sezionare ulteriormente specifici difetti immunitari all'interno di diversi livelli di difesa vegetale, compresi l'acido salicilico (SA) Immunità -Triggered (STI) e Immunità MAMP-Triggered (MTI).
Introduction
A causa della loro natura, sessili, piante sono costantemente minacciati da una pletora di agenti patogeni che espongono diversi stili di vita e le strategie nutrizionali 1. In prima approssimazione, gli agenti patogeni biotrofici mantengono il loro ospite vivo per recuperare le sostanze nutritive, mentre agenti patogeni necrotrophic tossine attivamente segreti ed enzimi per uccidere tessuto ospite e nutrono le cellule morte 1. Un altro gruppo di agenti patogeni, hemibiotrophs chiamati, inizia il loro corso l'infezione con il palco biotrofico e si sposta alla fase necrotrophic al raggiungimento di una certa soglia di accumulo patogeno 2. Al fine di difendersi efficacemente contro questi microrganismi, piante hanno sviluppato un complesso sistema immunitario innato dotato di molteplici meccanismi di sorveglianza per rilevare l'attacco patogeno e innescare localizzato morte cellulare programmata 3 e sistemica la resistenza acquisita (SAR) 4. La ricerca attuale è focalizzata sulla caratterizzazione del sig essenzialenaling componenti e incrociati colloqui all'interno del sistema immunitario pianta 5.
Come proposto nel modello "zigzag" 5, il primo strato della risposta immunitaria innata pianta richiede la presenza di plasma-membrana localizzata Motivo recettori di riconoscimento (PRR) per rilevare l'invasione di un microbo. PRR sono in grado di riconoscere i modelli Microbe-Associated Molecular (mAmps) e stabilire Immunità MAMP-Triggered (MTI) 6. Oltre ad indurre una upregulation trascrizionale di geni che codificano le proteine PR antimicrobici 7, MTI porta ad una serie di eventi che arrestare la crescita dei patogeni, inclusa la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e reattive di azoto specie (RNS), deposizione di callosio a parete cellulare nonché l'attivazione della chinasi di segnalazione molteplici vie 8.
Fino ad oggi, diversi piani di gestione pluriennali sono stati identificati per innescare MTI in Arabidopsis, compresi flg22 batterica 9 </sup> (Un frammento di acido 22 aminoacidi derivato da flagellina), elf18 10 (18 aminoacidi dalla batterica fattore di allungamento Tu) e un componente strutturale della parete cellulare peptidoglicani 11. Per stabilire una infezione di successo, alcuni patogeni specializzate hanno sviluppato la capacità di proteine effettrici virulenza segrete negli spazi intracellulari o intercellulari, e quindi reprimere MTI e innescare suscettibilità Effector-Triggered (ETS) 12,13. Ad esempio, effettori di virulenza possono inattivare proteine Mitogen-chinasi attivata (MAPK) fosforilazione cascate di MTI per indurre lo sviluppo della malattia entro il tessuto infetto 14-16. Durante la co-evoluzione dinamica tra host e patogeni, piante anche sviluppato la strategia di contrattacco di riconoscere le proteine effettrici e attenuare la virulenza patogeno molecole 17. Questo riconoscimento diretto o indiretto effettrici è mediata dalla resistenza alle malattie (R) 18 proteine. La maggior parte di torlo sono membri di NB-LRR (Nucleotide Binding e leucina-ricchi ripetizioni) della famiglia 19. La percezione di un effettore avirulent da una proteina R provoca una risposta più forte e più ampia immunitario caratterizzato come Immunità Effector-Triggered (ETI) 20. Oltre inducendo l'espressione di geni di difesa 21 e la produzione di metaboliti difesa 22, ETI spesso porta ad una rapida morte cellulare programmata localizzata noto come Hypersensitive Response (HR) per limitare il patogeno di diffondersi nel tessuto adiacente 3.
Oltre alla morte cellulare programmata localizzato 23, le piante sono in grado di avviare un lungo periodo e risposta immunitaria a livello di sistema denominato Systemic Acquired Resistance (SAR) 4. Su sfida con un agente patogeno biotrofico, cellule vegetali innescano la biosintesi e l'accumulo di un phytohormone endogena acido salicilico (SA) e delle proteine PR in entrambi i tessuti locali e sistemiche 24. Attraverso til suo processo, un elevato stato di preparazione si ottiene nelle foglie non infetti che consente il montaggio risposte di difesa veloce durante una successiva infezione da un ampio spettro di agenti patogeni 24. SA ed i suoi analoghi sintetici come benzo (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioic estere dell'acido S-metil (BTH) e acido 2,6-dichloroisonicotinic (INA) sono in grado di indurre chimicamente acido salicilico (SA) Immunità -Triggered (STI), su richiesta esterna 24. Nonexpressor di-Patogenesi correlati geni 1 (NPR1) si propone di essere uno dei recettori SA e funziona come un regolatore trascrizionale importante durante risposta di difesa SA-mediata sia nei tessuti locali e sistemiche 21,25,26. E 'stato definitivamente dimostrato che NPR1 è necessario per istituzione SAR e la perdita di NPR1 conduce alla drammatica suscettibilità verso Pseudomonas syringae 25.
Per caratterizzare ampiamente il contributo molecolare della piantacomponenti nelle interazioni pianta-patogeno, molteplici test biologici sono stati sviluppati per misurare gli eventi di difesa specifici, tra cui i ROS scoppio 27, callosio di deposizione 28, espressione geni di difesa e l'accumulo dei loro prodotti proteici 21. Mentre questi dosaggi individuali possono fornire intuizioni in una forma specifica della risposta immunitaria pianta, nessuno di essi, tuttavia, sono in grado di rappresentare la risposta di difesa completa sull'intera livello di impianto. Al contrario, la quantificazione della crescita dei patogeni dopo l'infezione fornisce una stima complessiva della risposta immunitaria a livello di organismi. Pertanto, lo sviluppo e l'ottimizzazione di un preciso e altamente standardizzata saggio patogeno inoculazione è fondamentale per alimentare la ricerca e le scoperte sulle risposte immunitarie Arabidopsis.
Pseudomonas syringae, un batterio Gram-negativi, è stato identificato come un phytopathogen in grado di causare la malattia in una vasta gamma di piante ospiti tra cui Arabidopsè 29. Poiché il sistema pianta-patogeno modello Arabidopsis – P. interazione syringae è stato ampiamente applicato per comprendere i meccanismi molecolari alla base della pianta risposte di difesa 29. Finora, oltre 50 P. patovar syringae sono stati identificati in base alla loro capacità di infettare diverse specie vegetali 30 . P. syringae pv. DC3000 pomodoro (Pst DC3000) 31 e P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 sono i due ceppi virulenti più utilizzati e ampiamente caratterizzate. Oltre ad essere riconosciuto dalla pianta e innescando la risposta MTI, Pst DC3000 e Psm ES4326 sono in grado di secernere proteine effettrici virulenti per sopprimere MTI e attivare ETS per favorire la crescita del 31,33 patogeno.
Per sezionare funzionalmente l'interazione tra Arabidopsis e P. syringae, multiplo0; metodi di infezione patogeni sono stati sviluppati sulla base del metodo di consegna patogeno. Per gli impianti di terreno coltivati, agente patogeno può essere trasportata da siringa infiltrazione, infiltrazione di vuoto, tuffo inoculazione e spruzzo inoculazione 29,34. Recentemente, piantina saggio alluvione-inoculazione è stato sviluppato per eseguire grandi schermi su colture di tessuti piastre-grown giovani piante di Arabidopsis 35. Siringa infiltrazione, come una delle soluzione più utilizzata, garantisce manualmente patogeno nel nell'apoplasto attraverso le aperture dell'anta naturale chiamati stomi 29. Attraverso questo approccio, gli importi uguali di P. syringae può essere infiltrato nella foglia infetta e la forza della risposta immunitaria pianta è inversamente correlato ai livelli di crescita dei patogeni. Pertanto, la quantificazione della crescita dei patogeni serve come un approccio ottimale per valutare la funzione immunitaria a livello di tutta la pianta. Inoltre, siringa infiltrazione può distinguere il tessuto locale e sistemica, che può be applicabile nel caratterizzare i meccanismi molecolari alla base SAR 36.
Nel seguente protocollo, si descrive una siringa infiltrazione dosaggio ottimizzato con PSM ES4326 per lo screening mutanti di Arabidopsis per una maggiore suscettibilità alle malattie (EDS). Questo protocollo si avvarrà di due genotipi di Arabidopsis: una wild-type ecotipo Columbia-0 (Col-0) piante (controllo) e mutanti npr1-1 perdita di funzione (ipersensibili) che sarà infettato con ceppo batterico virulento Psm ES4326 37. Il mutante npr1-1 porta una mutazione puntiforme all'interno della sequenza consenso ankyrin-repeat della molecola NPR1, che altera la istidina altamente conservata in tirosina e rende la proteina non funzionale 25. Inoltre, una serie di modifiche del dosaggio siringa infiltrazione sono descritte che consentono la quantificazione dei difetti negli strati specifici della risposta immunitaria, compresi MTI e STI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la diminuzione a disposizione terreni agricoli e l'aumento della popolazione, i ricercatori di tutto il mondo sono sfidati con le esigenze urgenti per il miglioramento delle colture. Il rendimento può essere notevolmente influenzato da vari stress biotici e abiotici. Tra questi, l'infezione patogeno è una delle principali cause di riduzione della resa delle colture, responsabile di circa il 12% delle perdite solo 45 negli Stati Uniti. Per risolvere questo problema, la ricerca massiccia è stata …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.
Materials
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12×6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11×21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11×21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity – direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses – the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
