Бактериальный лист инфильтрация Анализ на тонкой Характеристика защитных реакций растений с помощью<em> Резуховидка Таля-Pseudomonas syringae</em> Pathosystem
Summary
Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.
Abstract
При отсутствии специализированных мобильных иммунных клеток, растения используют их локализованы запрограммированная смерть клеток и системной приобретенной устойчивости, чтобы защитить себя от атаки патогена. Вклад конкретного гена из Arabidopsis в целом растений иммунного ответа может быть специально и количественную оценку путем анализа роста патогенных микроорганизмов в пределах инфицированной ткани. На протяжении более трех десятилетий, hemibiotrophic бактерия Pseudomonas syringae ру. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) широко применяется в качестве модели для исследования возбудителя молекулярные механизмы, лежащие в основе иммунного ответа Arabidopsis. Чтобы доставить болезнетворных микроорганизмов в ткань листьев, несколько методов прививки были созданы, например, шприц инфильтрация, падение прививки, спрей, вакуумной пропитки, и наводнение прививка. Следующий протокол описывает метод оптимизированный шприц инфильтрации доставить яростную PSM ES4326 в листьях взрослыхПочва выращенных растений Arabidopsis и точно экран для повышения восприимчивости болезни (EDS) к этим патогеном. Кроме того, этот протокол может быть дополнен несколькими предварительной обработки для дальнейшего рассекать специфические иммунные дефекты в разных слоях оборонного завода, в том числе салициловой кислоты (SA) -Triggered иммунитета (ИППП) и MAMP запускаемые иммунитета (MTI).
Introduction
Из-за их природы сидячие, растения постоянно угрожает множество возбудителей, обладающих различные образ жизни и пищевые стратегии 1. В первом приближении биотрофных патогены поддерживать своего хозяина живым, чтобы получить питательные вещества, в то время как некротрофным патогенов активно тайные токсины и ферменты, чтобы убить ткани хозяина и питаются мертвыми клетками 1. Другая группа возбудителей, называемых hemibiotrophs, начинается их заражения курс с биотрофных этапе и сдвигов в некротрофным этапе при достижении определенного порога накоплению возбудителя 2. Для того чтобы эффективно защитить себя от этих микроорганизмов, растений развились сложный врожденной иммунной системы оснащена несколькими механизмами наблюдения для обнаружения атаки патогена и вызвать локализованного запрограммирован гибель клеток 3, а также системной приобретенной устойчивости (SAR) 4. Текущее исследование сосредоточено на характеризующий существенную сиговыхnaling компоненты и кросс-переговоры в растительной иммунной системы. 5
Как предлагается в "зигзагообразный" модели 5, первый слой растительного врожденного иммунного ответа требуется наличие плазматической мембраны локализованные распознавание образов рецепторы (РРСС) для обнаружения вторжения микроба. PRRs способны распознавать Микроб-Ассошиэйтед молекулярные модели (MAMPs) и установить MAMP запускаемые иммунитет (MTI) 6. Кроме того, вызывая транскрипции активацию генов, кодирующих антимикробные PR белки 7, MTI приводит к различным событиям, что арест рост патогенных микроорганизмов, в том числе производства реактивных форм кислорода (ROS), и химически активного азота видам (RNS), осаждения каллозы к клеточной стенке а также активацию киназы множественных сигналов дорожками 8.
До сих пор, несколько MAMPs не были определены для запуска MTI в Arabidopsis, в том числе бактериальной flg22 9 </sup> (Фрагмент 22 аминокислоты получены из флагеллином), elf18 10 (18 аминокислот из бактериального фактора элонгации трансляции ТУ) и структурного компонента клеточной стенки Пептидогликаны 11. Для создать успешный инфекции, некоторые специализированные патогены развили способность к секретным белков вирулентности эффекторных в внутриклеточные или межклеточных пространствах, и, следовательно, подавлять MTI и вызвать Эффектор запускаемые восприимчивости (ETS) 12,13. Например, вирулентности эффекторы могут инактивировать митогеном активируемой протеинкиназы (МАРК) фосфорилирования каскады MTI, чтобы вызвать развитие заболевания в инфицированной ткани 14-16. Во время динамического коэволюции между хостами и патогенов, растения также разработали стратегию ответных признать эффекторные белки и ослабления вирулентности патогена молекул 17. Это прямое или косвенное признание эффектор опосредуется болезнеустойчивости (R) белков 18. Большинство тподол являются членами NB-LRR (нуклеотидов Переплет и лейцин-богатый повторов) семьи 19. Восприятие авирулентный эффектора с помощью R белка вызывает более сильное и широкое иммунный ответ характеризуется как эффектор-Срабатывает иммунитет (ETI) 20. Кроме индукции экспрессии генов 21 оборонных и производство оборонной метаболитов 22, ВЦ часто приводит к быстрому локализованной запрограммированной гибели клеток, известной как реакции гиперчувствительности (HR), чтобы ограничить распространение возбудителя из в соседнюю ткань 3.
В дополнение к локализованным запрограммированной клеточной смерти 23 заводов способны инициировать долгосрочные и общесистемного иммунный ответ называют системной приобретенной устойчивости (SAR) 4. При стимуляции с биотрофных патогена, клетки растений вызвать биосинтез и накопление эндогенного фитогормонов салициловой кислоты (SA) и PR белков в обеих местных и системных тканях 24. Через тего процесс, состояние повышенной готовности достигается в неинфицированных листьях, что позволяет для монтажа быстрее ответов обороны во время последующей инфекции широкого спектра возбудителей 24. С. и его синтетические аналоги, такие как бензо- (1,2,3) тиадиазол-7-тиокарбоновой кислоты метиловый эфир уксусной кислоты S (BTH) и 2,6-дихлоризоникотиновая кислоты (INA) способны индуцировать химически салициловой кислоты (СК) -Triggered Иммунитет (ИППП) по внешним приложением 24. Nonexpressor патогенеза-родственные гены (1) NPR1 предлагается один из рецепторов SA и функций в качестве основного регулятора транскрипции во SA-опосредованной реакции обороны в местных и системных тканях 21,25,26. Было убедительно показано, что NPR1 требуется для создания SAR и потеря NPR1 приводит к драматическим восприимчивости по отношению к Pseudomonas syringae 25.
Для широко характеризуют молекулярный вклад заводакомпоненты растительных патогенов взаимодействий, несколько биопробы были разработаны для измерения конкретных оборонных мероприятий, в том числе АФК взрыв 27 каллозы осаждения 28, выражение генов обороны и накопление их белковых продуктов 21. В то время как эти отдельные тесты могут дать представление конкретной форме растительной иммунного ответа, ни один из них, однако, не в состоянии представлять полный ответ обороны на уровне всего предприятия. Наоборот, количественная оценка роста патогенных микроорганизмов после заражения дает общую оценку иммунного ответа на организменном уровне. Таким образом, разработка и оптимизация точной и высоко стандартизированной возбудитель прививки анализе важно, чтобы питать до исследования и открытия на иммунных ответов Arabidopsis.
Pseudomonas syringae, грамотрицательная бактерия, был идентифицирован как фитопатогенов, способных вызвать заболевание в диапазоне растений-хозяев, включая Arabidopsсоставляет 29. В качестве модели растений патогена системы, Arabidopsis – P. syringae взаимодействие широко применяется, чтобы понять молекулярные механизмы лежащие в основе растительных обороны ответов 29. До сих пор, более 50 П. syringae pathovars были определены на основе их способности инфицировать различные виды растений 30 . П. syringae ру. помидор DC3000 (PST DC3000) 31 и П. syringae ру. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 являются двумя наиболее широко используемых и широко отличающиеся вирулентные штаммы. Помимо того, что признается завода и запуск ответ MTI, Pst DC3000 и Psm ES4326 способны секретировать вирулентных эффекторных белков, чтобы подавить MTI и вызвать ETS в пользу роста 31,33 патоген.
Функционально анализировать взаимодействие между Arabidopsis и P. syringae, несколько0; патогенных методы инфекции были разработаны на основании подхода доставки патоген. Для почвенных выращенных растений, возбудитель может быть доставлен с помощью шприца инфильтрации, вакуумной инфильтрацией, погруженной прививки и прививки распыления 29,34. Недавно рассады наводнения прививка был разработан анализ для выполнения крупномасштабных экраны на планшеты для тканевых культур, выращенных молодых растений Arabidopsis 35. Шприц инфильтрация, в качестве одного из наиболее часто используемых подходом, вручную подает возбудителя в апопласт через естественный листьев отверстий, называемых устьиц 29. Благодаря такому подходу, равные количества P. syringae может быть проникли зараженного листа и сила растений иммунного ответа обратно пропорциональна уровней роста патогена. Таким образом, количественная оценка роста патогенных микроорганизмов служит в качестве оптимального подхода для оценки иммунной функции у уровне целого растени. Кроме того, шприц инфильтрации можно выделить местных и системных ткани, которые могут бе применяется для характеристики молекулярных механизмов, лежащих в основе 36 SAR.
В следующем протоколе мы опишем оптимизированный шприц инфильтрации анализа с PSM ES4326 на экран Arabidopsis мутантов для повышения восприимчивости болезни (EDS). Этот протокол будет использовать два Arabidopsis генотипов: дикого типа экотип Колумбия-0 (Col-0) растения (контроль) и npr1-1 потери из-мутанты функции (hypersusceptible) что будет заражен вирулентных бактериального штамма PSM ES4326 37. Npr1-1 мутант несет точечную мутацию в пределах анкириновых повтора консенсусной последовательности молекулы NPR1, который изменяет высоко законсервированный гистидин в тирозин и оказывает белок нефункциональные 25. Кроме того, ряд модификаций шприц инфильтрации анализа описаны, что позволяет количественно определить дефекты в конкретных слоев иммунного ответа, в том числе MTI и ИППП.
Protocol
Representative Results
Discussion
С уменьшением доступного сельхозугодий и ростом численности населения, исследователи во всем мире сталкиваются с проблемой насущных потребностей для улучшения сельскохозяйственных культур. Выход может быть значительной степени зависит от различных биотических и абиотических стре?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.
Materials
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12×6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11×21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11×21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity – direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses – the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
