חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em> Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em> Pathosystem
Summary
Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.
Abstract
בהיעדרם של תאים חיסוניים ניידים מיוחדים, צמחים לנצל מקומי מותם המתוכנת תא והמערכתי נרכשת ההתנגדות להגן על עצמם נגד התקפת הפתוגן. תרומתו של גן ארבידופסיס ספציפי לתגובה החיסונית הצמח הכולל יכולה להיות ספציפי וכמותית הוערכה על ידי מנסה לאמוד את צמיחת הפתוגן בתוך הרקמה נגועה. במשך יותר משלושה עשורים, את חיידק Pseudomonas hemibiotrophic syringae PV. Maculicola ES4326 (ES4326 PSM) כבר מיושם באופן נרחב כמחולל מחל המודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התגובה החיסונית ארבידופסיס. כדי לספק פתוגנים לתוך רקמת העלה, שיטות חיסון מרובות הוקמו, למשל, חדירת מזרק, חיסון טבילה, ריסוס, חדירת אבק, וחיסון מבול. הפרוטוקול הבא מתאר שיטת חדירת מזרק מותאמת לספק ארסי PSM ES4326 לעלים של מבוגריםהאדמה גדלה צמחי ארבידופסיס ומדויק למסך לרגישות משופרת מחלה (EDS) לפתוגן זו. בנוסף, פרוטוקול זה ניתן להשלים עם-טיפולים מראש מרובים לנתח נוסף פגמים חיסוניים ספציפיים בתוך שכבות שונות של הגנת צומח, הכוללים חומצה סליצילית (SA) חסינות -Triggered (STI) וחסינות מופעלת על-MAMP (MTI).
Introduction
בשל אופיים הנייח, צמחים מאוימים ללא הרף על ידי שפע של פתוגנים המציגים את אורח החיים שונים ואסטרטגיות תזונתיות 1. להערכה ראשונה, פתוגנים biotrophic לשומרם מארח בחיים כדי לאחזר חומרים מזינים, ואילו רעלים באופן פעיל סוד פתוגנים necrotrophic ואנזימים להרוג רקמת מארח ולהאכיל על התאים המתים 1. קבוצה נוספת של פתוגנים, hemibiotrophs מכונה, מתחילה כמובן הזיהום שלהם עם שלב biotrophic ומשמרות לשלב necrotrophic עם הגיע לסף מסוים של הפתוגן הצטברות 2. על מנת להגן על עצמם יעילות נגד מיקרואורגניזמים אלה, צמחים התפתחו מערכת חיסון מולדת מסובכת מצויד במנגנון מעקב מרובה כדי לזהות את התקפת הפתוגן ולעורר מקומיים מתוכנת תא מוות 3, כמו גם התנגדות המערכתית נרכשת (SAR) 4. על אפיון sig החיוני מחקר נוכחי מתמקדרכיבי naling וצלב-שיחות בתוך המערכת החיסונית הצמח 5.
כפי שהוצע במודל "זיג-זג" 5, השכבה הראשונה של התגובה החיסונית המולדת הצמח דורשת הנוכחות של תבנית-מקומי קרום פלזמה ההכרה רצפטורים (PRRs) כדי לזהות את הפלישה של חיידק. PRRs מסוגל לזהות דפוסי חיידקים, Associated מולקולרי (MAMPs) ולהקים חסינות מופעלת על-MAMP (MTI) 6. מלבד גרימת upregulation תעתיק של גני המקודדים חלבוני יחסי ציבור מיקרוביאלית 7, MTI מוביל למגוון רחב של אירועים שיעצור את צמיחת הפתוגן, כוללים הייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) ומיני חנקן תגובתי (RNS), בתצהיר של callose לקיר התא כמו גם את ההפעלה של איתות קינאז מרובה מסלולי 8.
עד עכשיו, כמה MAMPs זוהה להפעיל MTI בארבידופסיס, לרבות flg22 חיידקי 9 </sup> (שבר 22 חומצות אמינו הנגזר מflagellin), elf18 10 (18 חומצות אמינו מגורם חיידקי התארכות תרגום ט"ו) וקיר תא רכיב מבני peptidoglycans 11. להקים זיהום מוצלח, כמה פתוגנים מיוחדים התפתחו יכולת חלבוני מפעיל אלימות סוד לחללים תאיים או אינטר, וכתוצאה מכך להדחיק MTI ולעורר רגישות מופעלת על-מפעיל (ETS) 12,13. לדוגמא, effectors הארסיות יכולה להשבית מפלי קינאז זירחון (MAPK) חלבון פעיל-mitogen של MTI לגרום להתפתחות המחלה בתוך הרקמה נגועה 14-16. במהלך שיתוף האבולוציה הדינמית בין מארחים ופתוגנים, צמחים פיתחו גם את אסטרטגית התקפת נגד להכיר חלבוני מפעיל ולהחליש את ארסיות הפתוגן מולקולות 17. הכרת מפעיל ישירה או עקיפה זה מתווכת על ידי התנגדות מחלה חלבונים (R) 18. רוב tאמרה הן חברים של NB-LRR (נוקלאוטיד כריכה ולאוצין-ריץ חזרות) משפחה 19. התפיסה של מפעיל לֹא אַלִים ידי חלבון R מעורר תגובה חיסונית חזקה יותר ורחב יותר מאופיינת כחסינות מופעלת על-מפעיל (ETI) 20. מלבד גרימת הביטוי של גני ההגנה 21 והייצור של מטבוליטים הגנה 22, אתי לעתים קרובות מוביל למוות מהיר מקומי לתכנת תאים הידועים כרגישה להפליא תגובה (HR) כדי להגביל את הפתוגן מלהתפשט לרקמות הסמוכות 3.
בנוסף למקומי מתוכנת המוות של תאי 23, צמחים מסוגלים ליזום טווח ארוך ותגובה חיסונית מערכתית כינה מערכתית נרכשת התנגדות (SAR) 4. על אתגר עם הפתוגן biotrophic, תאי צמח לעורר את ביוסינתזה והצטברות של חומצה סליצילית phytohormone אנדוגני (SA) וחלבוני יחסי הציבור בשתי רקמות מערכתיות ומקומיות 24. באמצעות tהתהליך שלו, מדינה מוגברת של מוכנות מושגת בעלים נגוע המאפשר להרכבת תגובות הגנה מהירות יותר במהלך זיהום לאחר מכן על ידי קשת רחבה של פתוגנים 24. SA ותחליפיו סינטטיים כגון benzo- (1,2,3) -thiadiazole 7-carbothioic-אסתר -methyl S החומצה (BTH) וחומצת 2,6-dichloroisonicotinic (INA) מסוגלים כימי התרמה חומצה סליצילית (SA) חסינות -Triggered (STI) על יישום חיצוני 24. Nonexpressor של גנים הקשורים פתוגנזה 1 (NPR1) מוצע לאחד את הקולטנים SA ומתפקד כרגולטור תעתיק עיקרי בתגובת הגנת תיווך SA בשתי רקמות מערכתיות ומקומיות 21,25,26. הוכח בודאות כי NPR1 נדרש לכינון SAR ואובדן NPR1 מוביל לרגישות דרמטית לקראת syringae Pseudomonas 25.
הרחבה לאפיין את התרומה המולקולרית של צמחרכיבים באינטראקציות צמח לפתוגן, bioassays מרובה פותחו כדי למדוד אירועים ביטחוניים ספציפיים, כולל ROS פרץ 27, callose תצהיר 28, ביטוי גני הגנה והצטברות של מוצרי החלבון שלהם 21. בעוד מבחני הבודדים אלה יכולים לספק תובנות צורה מסוימת של התגובה החיסונית הצמח, אף אחד מהם, לעומת זאת, יכול לייצג את תגובת הגנה המלאה ברמת המפעל כולו. לעומת זאת, כימות של צמיחת הפתוגן לאחר ההדבקה מספקת הערכה כוללת של תגובה חיסונית ברמת האורגניזם. לכן, הפיתוח ואופטימיזציה של assay חיסון הפתוגן מדויק ואחיד ביותר הוא קריטי לדלק את המחקר ותגליות בתגובות החיסונית ארבידופסיס.
Pseudomonas syringae, חיידק גראם שלילי, זוהה כphytopathogen מסוגל לגרום למחלות במגוון של מארחי מפעל כולל Arabidopsהוא 29. כמערכת מודל הצמח לפתוגן, ארבידופסיס – פ האינטראקציה syringae כבר מיושמת באופן נרחב כדי להבין את המנגנונים המולקולריים תגובות הגנת צמח בסיס 29. עד עכשיו, יותר מ- 50 P. pathovars syringae זוהה על סמך יכולתם כדי להדביק מיני צמחים שונים 30 . פ syringae PV. DC3000 עגבניות (PST DC3000) 31 ופ syringae PV. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 שני זנים אלימים ביותר בשימוש נרחב והרחבה המאופיינת. מלבד להיות מוכר על ידי המפעל ומפעיל את תגובת MTI, PST DC3000 וPSM ES4326 מסוגל להפריש חלבוני מפעיל ארסיים לדכא MTI ולעורר ETS להעדיף 31,33 צמיחת הפתוגן.
פונקציונלי לנתח את האינטראקציה בין ארבידופסיס ופ syringae, מרובה0; שיטות זיהום הפתוגן פותחו בהתבסס על גישת מסירת הפתוגן. לצמחים שגודל באדמה, הפתוגן יכול להיות מועבר על ידי חדירת מזרק, חדירת אבק, חיסון טבילה וחיסון תרסיס 29,34. לאחרונה, assay שיטפון חיסון השתיל פותח כדי לבצע מסכי בקנה מידה גדול בתרבית רקמת צלחות גדלו צמחי ארבידופסיס צעירים 35. חדירת מזרק, כאחד מהגישה הנפוצה ביותר, באופן ידני מספקת את הפתוגן לאפופלסט דרך הפתחים טבעי העלה כינו הפיוניות 29. באמצעות גישה זו, כמויות שווה מפ syringae יכול להיות חדר לעלה הנגוע ואת הכוח של תגובה חיסונית מפעל בקורלציה הופך לרמות צמיחת הפתוגן. לכן, כימות של צמיחת הפתוגן משמשת כגישה אופטימלית כדי להעריך את תפקוד מערכת החיסון ברמת המפעל כולו. בנוסף, חדירת מזרק יכולה להבחין הרקמה מערכתית והמקומית, שיכול בדואר החל באפיון המנגנונים המולקולריים שבבסיס SAR 36.
בפרוטוקול הבא, אנו מתארים assay חדירת מזרק מותאם עם PSM ES4326 למסך מוטציות ארבידופסיס לרגישות מוגברת למחלות (EDS). פרוטוקול זה יעסיק שני גנוטיפים ארבידופסיס: אקוטיפ wild-type קולומביה-0 (Col-0) צמחים (שליטה) ומוטציות פסד של הפונקציה npr1-1 (רגיש במידה קיצונית) אשר נגוע בזן חיידקים הארסי PSM ES4326 37. המוטציה npr1-1 נושאת מוטציה נקודה בתוך רצף קונסנסוס ankyrin-חוזר של מולקולת NPR1, אשר משנה את היסטידין השמור ביותר לטירוזין והופך את החלבון שאינו פונקציונלי 25. בנוסף, מספר השינויים של assay חדירת מזרק מתואר המאפשר כימות של פגמים בשכבות מסוימות של תגובה חיסונית, כולל MTI וSTI.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהפחתה חקלאית זמין והגדלת אוכלוסייה, חוקרים ברחבי העולם מאותגרים עם צרכי דחופים ליבול השבחה. התשואה יכולה להיות מושפעת במידה רבה מלחצי יוטיים ואביוטי מגוון. ביניהם, זיהום הפתוגן הוא אחד הגורמים המובילים של הפחתת תשואת יבול, אחראי לכ -12% הפסדים בארה"ב 45 בלבד. כ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.
Materials
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12×6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11×21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11×21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity – direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses – the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
