Method Article

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae) Pathosystem

DOI:

10.3791/53364

⸱

October 1st, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

In This Article

Summary

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병원체 성장의 정량화는 다양한 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(Arabidopsis) 면역 반응을 특성화하는 강력한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 Pseudomonas syringae pv를 정량화하기 위해 최적화된 주사기 침투 분석을 제공합니다. 마쿨리콜라 성체 애기장대에서 ES4326 성장.

Abstract

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전문 모바일 면역 세포의 부재에서, 식물은 현지화 프로그램 된 세포의 죽음과 전신 획득 저항성이 병원균의 공격으로부터 자신을 방어하기 위해 사용한다. 전체 식물 면역 반응 애기 특정 유전자의 기여는 구체적 정량적으로 감염된 조직 내의 병원균의 성장을 분석하여 평가할 수있다. 지난 3 년 동안의 hemibiotrophic 세균은 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae) 태양 광 발전. maculicola ES4326 (PSM의 ES4326)는 널리 애기 면역 반응의 기초가되는 분자 메커니즘을 조사하기 모델 병원체로 적용되었습니다. 잎 조직으로 병원균을 제공하는, 다중 접종 방법이 확립되어, 예를 들면, 주사기 침윤 접종 딥, 스프레이, 진공 침윤, 홍수 접종. 다음 프로토콜은 성인의 잎으로 병원성 PSM ES4326를 전달하도록 최적화 된 주사기 침투 방법을 설명하는데애기 장대 식물을 토양에서 재배하고 정확하게이 병원균으로 강화 된 질병 감수성 (EDS)을 선별. 또한,이 프로토콜은 상기 살리실산 (SA) -Triggered 내성 (STI)와 MAMP 트리거 내성 (MTI)를 포함한 식물 방어 다른 층 내의 특정 결함 면역 해부 여러 전처리를 보충 할 수있다.

Introduction

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때문에 자신의 고착 자연, 식물은 지속적으로 다양한 라이프 스타일과 영양 전략 1을 나타내는 병원균의 과다에 의해 위협을 받고있다. necrotrophic 병원균 적극적으로 비밀 독소와 효소가 호스트 조직을 죽이고 죽은 세포 (1)에 공급하는 동안 첫 번째 근사, biotrophic 병원균, 영양분을 검색 할 수 살아 자신의 호스트를 유지한다. 병원균이라고 hemibiotrophs의 또 다른 그룹은 병원체의 축적 (2) 특정 임계 값에 도달시 necrotrophic 단계에 biotrophic 무대와 변화와의 감염 과정을 시작합니다. 효과적으로 이들 미생물로부터 자신을 방어하기 위해, 식물 병원체 공격을 검출 및 트리거하도록 여러 감시기구를 구비 한 복잡한 선천 면역을 진화 세포사 3뿐만 아니라 전신 획득 저항성 (SAR)을 4 프로그램 지역화. 현재의 연구는 필수 SIG의 특성에 초점을 맞추고naling 구성 요소와 식물 면역 체계 (5) 내에서 교차 회담.

"지그재그"모델 5에 제시된 바와 같이, 식물 선천성 면역 반응의 제 1 층은 미생물의 침입을 검출하는 세포막 지역화 패턴 인식 수용체....

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Protocol

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다음 텍스트는 애기 장대에서 PSM ES4326 주사기 침투 분석을 최적화 수행하기 위해 단계적으로 프로토콜을 설명합니다. 이 분석 주요 절차는 단순화 된 플로우 차트 (그림 1)에 표시됩니다.

1. 식물 성장 조건

  1. 소우 씨
    1. 느슨하게 바닥 O에서 그들을 담가 토양과 물을 냄비 가득 2 냄비 (직경 4, 높이 3.75)를 준비 / N 여분의 물을 배수하기 전에.
    2. 시트 나 다른 종이 무게 접힌 70mm 각 냄비, 50 ~ 100 애기 씨, 야생 형 골-0 또는 npr1-1 돌연변이를 뿌리고.
    3. 80-90% (그림 2A)에 상대 습도를 높이기 위해 물을 뿌려 투명 돔이있는 냄비를 커버.
  2. 전체 계층화 및 동기 발아 수 있도록 72 시간 동안 4 ° C에서 냄비를 품어.
  3. 표준 성장 조건에 냄비로 이동 (12 시간 빛/ 12 시간 어두운, 21 ° C, 빛의 세기 100 μmol / 평방 미터 / 초, 상대 습도 40 %)은 씨앗이 발아 할 수 있도록합니다. 물 응축을 방지하는 데 도움이됩니다 성장 방에 전송 직후 구....

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Results

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우리가 여기서 설명하는 프로토콜 최적화 (P)를 나타냅니다 syringae 주사기 침투 분석은 정량적으로 애기 장대 식물의 면역 반응을 알아보고자 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, PSM ES4326 주사기의 침윤은 연속 희석 콜로니 열거 통해 병원균 추출 및 정량 따른다.

프로토콜 텍스트 내에서 3 단계에서 설명 된 바와 같이, ES4326 PSM에 대해 향상된 질환 감수성 (EDS)를 OD = 0.0002으로 접종하여 감염에 의해 평가 될 수있다. 도 3에 도시 된 바와 같이, 고도로 민감한 npr1-1 돌연변이는 야생형 골 -0- 식물에 비해 약 2.5 로그 (300 배) 이상의 병원체의 성장이있다. 실험 조건에 따라 npr1-1 식물 1.5-2.5 로그의 범위 내에서 가장 일반적인 결과, 골 .......

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Discussion

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인구 available 농지 감소와 증가함에 따라, 전 세계의 연구자들은 작물 개선을위한 긴급한 필요로하는 과제를 안고 있습니다. 수율은 매우 다양한 생물학적 및 비 생물 적 스트레스에 의해 영향을받을 수있다. 그 중에서도, 병원체 감염 단독 45 US에서 약 12 %의 손실에 대해 책임 작물 수확량 감소의 주요 원인 중 하나이다. 이 문제를 해결하려면, 대규모 연구는 모델 애기 장대에서 진행되고있다 - P. syringae의 pathosystem 종합적 성분과 식물 면역 반응의 조절 메카니즘을 특성화. 여기서는 최적화 P. 제시 syringae ES4326 주사기 침투 분석은 정량적으로 전체 공장 수준에서 식물 면역 반응에 미묘한 차이를 평가합니다.

여러 병원체 감염 분석은 식물 29,35 면역 반응을 특성화하기 위해 개발되어 왔지만, 주사기 침투 제공병원균의 같은 양이 감염된 조직에.......

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Disclosures

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저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

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원고를 비평해 주신 Shahid Mukhtar 박사님과 샘플 데이터 분석 파일을 제공해 주신 Xinnian Dong 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 KPM과 UAB 생물학과에 NSF-CAREER 상(IOS-1350244)을 수여했습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
메트로믹스 360 GrosouthSNGMM360
대형 냄비GrosouthTEKUVCC10TC
12 x 6 인서트GrosouthLM1206
11x 21 구멍이 없는 아파트GrosouthLM1020
11x 21 구멍 있는 아파트GrosouthLM1020H
비닐 전파 돔GrosouthCW-221
Proteose PeptoneFisher ScientificDF0122-17-4
Potassium Phosphate 이염기성 삼수화물 MP 바이오메디컬151946
한천 Fisher ScientificA360-500
스트렙토마이신 설페이Bio Basic IncSB0494
100 x 15 mm 페트리 접시Fisher ScientificFB0875713
150 x 15 mm 페트리 접시Fisher ScientificR80150
직사각형 플레이트Fisher Scientific12-565-450 
MgCl2 HexahydrateBio Basic IncMB0328
글리세롤Bio Basic IncGB0232
MgSO4  Bio Basic IncMN1988
1 ml 주사기Fisher ScientificNC9992493 
KimwipeFisher Scientific06-666-A
연삭관 Denville ScientificB1257
그라인딩 튜브용 캡Denville ScientificB1254
스테인리스 스틸 그라인딩 볼Fisher Scientific2150
96-웰 플레이트 Fisher Scientific12-556-008
소듐 살리실레이트시그마 알드리치s3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)유전자 주문
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)유전자 스크립트주문
펀처스테이플146308
Biophotometer plusEppendorf
PowerGen High-Throughput HomogenizerFisher Scientific02-215-503
Accu 스핀 마이크로 원심분리기Fisher Scientific13-100-675
멀티채널 피펫 (10-100 &마이크로; l)Eppendorf3122 000.043
멀티채널 피펫 (30-300 µ l)Eppendorf3122 000.060
피펫 (20&마이크로; l)Eppendorf3120 000.038
피펫 팁Fisher Scientific3552-HR
Sharpie 영구 마커스테이플507130
1.5 ml 튜브Eppendorf22363204
집게Fisher Scientific08-890
트 제작제작 홀 952000006

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
  2. Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 ....

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Bacterial Leaf InfiltrationPlant Defense ResponsesArabidopsis thalianaPseudomonas syringaeSyringe Infiltration MethodEnhanced Disease SusceptibilitySalicylic Acid ImmunityMAMP Triggered ImmunityPathogen Growth QuantificationLeaf Tissue Homogenization

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