גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1
Summary
Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.
Abstract
Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.
Introduction
ביונקים, התקדמות מחזור התא תלויה אירועים הורה מאוד בשליטת cyclins ו קינאזות תלויות-ציקלין (Cdks) 1. באמצעות ציטופלסמית שלה, גרעיני, ולוקליזציה centrosomal, CyclinB1 / Cdk1 הוא מסוגל לסנכרן אירועים שונים מיטוזה כמו התפרקות מעטפת הגרעין ואת centrosome ההפרדה 2. CyclinB1 / Cdk1 ומגן על התאים mitotic נגד אפופטוזיס 3 ומקדם ביקוע המיטוכונדריה, צעד קריטי עבור חלוקה שווה של המיטוכונדריה לתאי הבת שהוקמה זה עתה 4.
בשינה מתרבה בתאי יונקים, המיטוכונדריה ATP מופק באמצעות זירחון חמצונים (OXPHOS) מכונה (שרשרת העברת אלקטרונים), אשר מורכבת של 5 מתחמים רב למקטע; אני מורכב – V המורכבת (CI-CV). Dinucleotide אדנין Nicotinamide (NADH): oxidoreductase ubiquinone או מורכב אני (CI) הוא הגדול והמובן פחות מחמשת מתחמי 5. ג המורכבonsists של 45 יחידות משנה, 14 מתוכם מהווים את הליבה קטליטי. לאחר הרכבה, במתחם מניח מבנה בצורת אות עם זרוע אחת בולט לתוך המטריצה ואת היד השנייה המוטבעת 6,7 הקרום הפנימי. מוטציות יחידות משנה CI הם הגורם במגוון הפרעות המיטוכונדריה 8. CI יעילה פונקציונלי OXPHOS נדרשה לא רק עבור נשימה המיטוכונדריאלי הכולל 9, אלא גם עבור התקדמות מחזור תא מוצלח 10. Unravelling המנגנונים העומדים בבסיס התפקוד מורכב אנזים קרום נכנס זה בבריאות ובחולי יכולים לאפשר הפיתוח של הליכי אבחון חדשניים אסטרטגיות טיפוליות מתקדמות. במחקר שנערך לאחרונה, מצאנו כי המתחם CyclinB1 / Cdk1 translocates לתוך המיטוכונדריה בשלב (גאפ 2) G2 / (מיטוזה) M ו- phosphorylates יחידות משנה CI להגביר את ייצור האנרגיה במיטוכונדריה, פוטנציאל לקזז הצרכים אנרגיה מוגברת של תאים במהלך התא מחזור 11. כאן אנו showcase נהלים אסטראטגי הניסיונות, שניתן להשתמש בם כדי ללמוד טרנסלוקציה המיטוכונדריה של קינאזות ציטופלסמית גרעינית / אחר, המצעים המיטוכונדריה שלהם, כמו גם השלכות תפקודיות של לוקליזציה המיטוכונדריה שלהם באמצעות CyclinB1 / Cdk1 כדוגמא.
הממצא כי מתחם CyclinB1 / Cdk1 translocates לתוך המיטוכונדריה בעת צורך יתבקש המחקרים של ביטוי יתר המיטוכונדריה ספציפי מציאה של מורכבות זו. כדי להשיג ביטוי המיטוכונדריה ספציפי של חלבונים, אפשר להוסיף רצף מיקוד המיטוכונדריה (MTS) ב N- הסופית של החלבון של עניין. המיטוכונדריה מיקוד רצפים לאפשר מיון של חלבונים המיטוכונדריה לתוך המיטוכונדריה שם הם בדרך כלל מתגוררים 12. השתמשנו רצף מיקוד 87 המיטוכונדריה בסיס נגזר מבשר של 8A למקטע מונואמין ג האנושי ציטוכרום (COX8) ו משובטים אותו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -tagged CyclinB1 או פלורסנט האדוםחלבון (RFP) -tagged Cdk1 המכילים פלסמידים מסגרת. שיטה זו אפשרה לנו למקד CyclinB1 ו Cdk1 לתוך המיטוכונדריה, שינוי הביטוי המיטוכונדריה במיוחד של חלבונים אלה מבלי להשפיע בריכת הגרעין שלהם. על ידי fluorescently תיוג חלבונים אלה, הצלחנו לפקח לוקליזציה שלהם בזמן אמת. באופן דומה, יש לנו הצגנו MTS לתוך פלסמיד המכיל דומיננטי-tagged RFP השלילי Cdk1, אשר אפשר לנו לדפוק במיוחד במורד הביטוי המיטוכונדריה ותפקידי Cdk1. זה חיוני כדי להבחין בין פונקציות המיטוכונדריה וגרעיניות של קינאזות שיש localizations כפול כמו Cdk1. הנדסת MTS לתוך הטרמינל N של קינאזות הפונקציונלי הכפול אלה מציעה אסטרטגיה גדולה כי הוא קל להיות מועסק ויעיל.
מאז Cdk1 הוא קינאז מחזור התא, והוא תהליך יסודי כדי לקבוע את התקדמות התא מחזור כאשר Cdk1 הוא מקומי לתוך המיטוכונדריה. כדי להשיג זאת, יש לנו מנוצל metho חדשד לפקח על תוכן DNA בתאים. שיטות מסורתיות כוללות שימוש BrdU (bromodeoxyuridine), אנלוגי thymidine סינטטי, אשר משלב לתוך ה- DNA המסונתז החדש בשלב S של מחזור התא להחליף thymidine. ואז התאים כי הם משכפלים DNA שלהם באופן פעיל ניתן לאתר באמצעות נוגדנים נגד BrdU. אחד חסרונות של שיטה זו הוא בכך שהיא דורשת denaturation של ה- DNA כדי לספק גישה של נוגדן BrdU בשיטות קשות כמו טיפול בחומצה או חום, דבר אשר עלול לגרום אי התאמה בין תוצאות 13,14. לחלופין, השתמשנו בגישה דומה כדי לפקח על תאים המתחלקים באופן פעיל עם אנלוגי thymidine שונה, edu. זיהוי edu אינו מחייב denaturation DNA קשה כטיפול ניקוי עדין מאפשר מגיב זיהוי לגשת EDU ב- DNA המסונתז חדש. שיטת edu הוכיחה להיות יותר אמין, עקבי עם פוטנציאל לניתוח תפוקה גבוהה 15.
לבסוף, to לקבוע מצעים המיטוכונדריה של Cdk1, השתמשנו בכלי פרוטאומיקה בשם 2D-DIGE, אשר היא גרסה מתקדמת של ג'ל אלקטרופורזה קלאסית דו מימדי. שני אלקטרופורזה ממדי מפרידה חלבונים על פי נקודת isoelectric שלהם במימד הראשון ועל משקל מולקולרי של השני. מאז שלאחר translational שינויים כגון זרחון וישפיע על נקודת isoelectric ועל משקל מולקולרי של חלבונים, ג'לים 2D יכול לזהות את ההבדלים בין סטטוסים זרחון של חלבונים בתוך מדגמים שונים. הגודל (שטח ועוצמה) של חלבון כתמים שינויים עם רמת הביטוי של חלבונים, המאפשר השוואה כמותית בין דוגמאות רבות. באמצעות שיטה זו, הצלחנו להבחין בין החלבונים פוספורילציה סוג בר לעומת תאי מבטאים המיטוכונדריה במיקוד מוטצית Cdk1. כתמי החלבון המסוימים שהראו את הסוג הבר אבל היו חסרים בהכנת Cdk1 המוטציה המיטוכונדריה במיקוד בודדושזוהו באמצעות ספקטרומטריית מסה.
ג'ל 2D המסורתי, צבעי triphenylmethane משמשים כדי להמחיש את החלבונים על הג'ל. 2D-DIGE משתמשת תוויות חלבון פלואורסצנטי עם השפעה מזערית על ניידות electrophoretic חלבון. יכולות להיות מתויגות דגימות חלבון שונות עם צבעי ניאון שונים, מעורבבים יחד מופרד על ידי ג'ל הזהה, המאפשרים-אלקטרופורזה השיתוף של דגימות מרובות על ג'ל בודד 16. הדבר מצמצם את וריאציות ג'ל אל-ג'ל, אשר מהווה בעיה קריטית במחקרים פרוטאומיקה מבוסס ג'ל.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמו חלבונים המיועדים אברונים subcellular אחרים, החלבונים ממוקד המיטוכונדריה להחזיק אותות מיקוד בתוך המבנה הראשוני או המשני שלהם כי להפנות אותם אברון בסיוע translocating חלבון משוכלל מכונות קיפול 21,22. המיטוכונדריה מיקוד רצפים (MTS) המתקבל חלבונים תושב המיטוכונדריה בלעדי כג…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.
Materials
| 32P ATP | PerkinElmer | BLU002001MC | |
| Anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11003 | Alexa-546 conjugated |
| Anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11029 | Alexa-488 conjugated |
| ATP | Research Organics | 1166A | For in vitro kinase assay |
| Cdk1 antibody | Cell Signaling Technology | 9112 | |
| Cdk1 kinase buffer | New England Biolabs | P6020S | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Life Technologies | C10337 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| COX IV antibody | Cell Signaling Technology | 4844S | For mitochondrial immunostaining |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-752 | |
| CyclinB1/Cdk1 enzyme complex | New England Biolabs | P6020S | Avoid freeze/thaw |
| CyDye DIGE Fluor Labeling Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25-8009-83 | |
| DIGE Gel and DIGE Buffer Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9480-26 AA | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 319937 | DMF |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 161-0611 | DTT |
| dNTP | EMD Millipore | 71004 | For site-directed mutagenesis |
| Dpn I enzyme | Stratagene | 200519-53 | For site-directed mutagenesis |
| Dry Strip cover fluid | GE Healthcare Life Sciences | 17-1335-01 | Used as mineral oil |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-03 | |
| EGTA | Acros Organics | 409910250 | |
| Eppendorf Vacufuge Concentrator | Fisher Scientific | 07-748-13 | Used as vacuum centrifuge concentrator |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | Anti-fade mounting solution |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | 649908 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| Histone H1 | Calbiochem | 382150 | For in vitro kinase assay |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For purifying DNA fragments from agarose gels |
| Immobiline DryStrip Gels | GE Healthcare Life Sciences | 18-1016-61 | IEF (isoelectric focusing) strips |
| Immobilized Glutathione | Thermo Scientific | 15160 | Glutathione-agarose beads |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | IAA |
| IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE Healthcare Life Sciences | 11-0033-64 | IPGphor strip holders |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside | RPI Corp | 156000-5.0 | IPTG |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L9783 | For cell lysis buffer |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent |
| Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | For CyDye labeling |
| Lysozyme | EMD Chemicals | 5960 | |
| Mitoctracker Red/Green | Invitrogen | M7512/M7514 | Mitochondrial fluorescent dyes |
| MOPS | EMD Chemicals | 6310 | |
| pEGFP-N1 | Clonetech | 6085-1 | GFP-expressing vector |
| Pfu | Stratagene | 600-255-52 | |
| pGEX-5X-1 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9545-53 | GST-expressing vector |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Shelton Scientific | IB01090 | PMSF |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040 | PBS |
| Spectra/Por 4 dialysis tubing | Spectrum Labs | 132700 | as porous membrane tubing for dialysis |
| Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain | Life Technologies | P-33300 | For staining phosphoproteins on 2D gels |
| Proteinase inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | For cell lysis buffer |
| QuikChange site-directed mutagenesis kit | Stratagene | 200519-5 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | MiniPrep Plasmid Isolation Kit |
| RO-3306 | Alexis Biochemicals | 270-463-M001 | Cdk1 inhibitor |
| Rotenone | MP Biomedicals | 150154 | Complex I inhibitor |
| Sodium carbonate | Fisher Scientific | S93359 | |
| Sodium chloride | EMD Chemicals | SX0420-5 | For cell lysis buffer |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | For cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Alfa Aesar | 33385 | For cell lysis buffer |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | L03425 | For cell lysis buffer |
| SpectraMax M2e | Molecular Devices | M2E | Microplate reader |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57-50-1 | |
| Tissue Grinder pestle | Kimble Chase | 885301-0007 | For mitochondria isolation |
| Tissue Grinder tube | Kimble Chase | 885303-0007 | For mitochondria isolation |
| Trichloroacetic acid solution | Sigma Aldrich | T0699 | TCA |
| Tris | MP Biomedicals | 103133 | |
| Triton-x-100 | Teknova | T1105 | |
| Trypsin | Calbiochem | 650211 | |
| Typhoon Imager | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Laser gel scanner fro 2D-DIGE |
| Ubiquinone | Sigma Aldrich | C7956 |
Referências
- Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
- Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
- Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
- Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
- Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
- Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
- Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
- Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
- Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
- Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
- Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
- Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
- Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3′-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
- Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic ‘click’ reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
- Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
- Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25 (2009).
- Davies, D., Macey, M. G. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. , 257-276 (2007).
- van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
- Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
- Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
- Karniely, S., Pines, O. Single translation–dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
- Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
- Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341 (2010).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
- Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
- Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).
