ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ
Summary
Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.
Abstract
Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.
Introduction
哺乳類では、細胞周期の進行は、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ（CDK）1によって制御される、高度に秩序イベントに依存しています。その細胞質、核、および中心体の局在化を通じ、サイクリン/ Cdk1のは、核エンベロープの破壊や中心体の分離2などの有糸分裂におけるさまざまなイベントを同期することができます。サイクリン/ Cdk1のは、アポトーシス3に対して有糸分裂細胞を保護し、ミトコンドリアの分裂、新たに形成された娘細胞4にミトコンドリアの平等な分配のための重要なステップを促進します。
哺乳動物細胞の増殖には、ミトコンドリアのATP、5マルチサブユニット複合体で構成されている酸化的リン酸化（OXPHOS）機械（電子伝達系）を介して生成されます。複合体I – 複雑なV（CI-CV）。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）：ユビキノン酸化還元酵素または複合体I（CI）は、5つの複合体5の理解最大と最小です。複雑なC45サブユニットの14のonsistsは、触媒コアを形成します。一旦組み立てられる、複合体は、1マトリックス内に突出するアームと内膜6,7に埋め込 まれ、他方のアームとL字型構造を前提としています。 CIサブユニットの変異は、ミトコンドリア病8の様々な原因です。 OXPHOSで機能的、効率的なCIが、全体的なミトコンドリア呼吸9のためだけでなく、成功した細胞周期進行10のためだけでなく、必要とされます。健康と病気で、この膜結合酵素複合体の機能のメカニズムをUnravellingする新規な診断手順と高度な治療戦略の開発を可能にすることができます。最近の研究では、サイクリン/ Cdk1の複合体が細胞中の細胞の増加したエネルギー需要を相殺する（ギャップ2）G2 /（有糸分裂）M期におけるミトコンドリアに移行し、潜在的に、ミトコンドリアのエネルギー産生を高めるために、CIサブユニットをリン酸化することを見出しましたサイクル11。ここでは、SHO実験手順および他の方法で核/細胞質キナーゼのミトコンドリア転移を研究するために使用することができます戦略、そのミトコンドリアの基質と同様の例として、サイクリン/ Cdk1のを使用して、ミトコンドリア局在の機能的結果をwcase。
必要なときにサイクリン/ Cdk1の複合体はミトコンドリアに移行していることを発見は、この複合体のミトコンドリア固有の過剰発現およびノックダウンの研究を促しました。蛋白質のミトコンドリア特異的発現を達成するためには、目的のタンパク質のN末端にミトコンドリアターゲティング配列（MTS）を追加することができます。配列を標的とするミトコンドリアは、彼らは通常、12を常駐ミトコンドリアへミトコンドリアタンパク質の選別を可能にします。我々は、サイクリンまたは赤色蛍光をタグ付きヒトシトクロムcオキシダーゼサブユニット8A（COX8）の前駆体から誘導された87塩基ミトコンドリアターゲティング配列を使用し、緑色蛍光タンパク質（GFP）にそれをクローン化してきましたタンパク質（RFP）がCdk1のがフレーム内にプラスミドを含むタグ付き。この方法は、具体的には、それらの核のプールに影響を与えることなく、これらのタンパク質のミトコンドリアの表現を変え、私たちはミトコンドリアにサイクリンとCdk1のをターゲットにすることができました。蛍光これらのタンパク質をタグ付けすることによって、我々はリアルタイムでそれらの局在をモニターすることができました。同様に、私たちは私たちは、特にCdk1のミトコンドリアの発現と機能をノックダウンすることができRFPタグ付きドミナントネガティブCdk1のを含むプラスミドにMTSを導入しています。 Cdk1のような二重のローカライズ版を持っているキナーゼのミトコンドリアと核の機能を区別することが不可欠です。これらの二重機能性キナーゼのN末端へのエンジニアリングMTSを採用することが容易かつ効果的である偉大な戦略を提供しています。
Cdk1のは、細胞周期キナーゼであるので、Cdk1のは、ミトコンドリアに局在している場合、細胞周期の進行を決定するために基本的です。これを達成するために、我々は、新しいメトを利用していますdは細胞におけるDNA含有量を監視します。従来の方法は、チミジンを置換するために、細胞周期のS期の間に新たに合成されたDNAに組み込まれたBrdU（ブロモデオキシウリジン）、合成チミジン類似体を用いることを含みます。そして積極的にそれらのDNAを複製している細胞を、抗BrdU抗体を用いて検出することができます。この方法の一つの欠点は、結果13,14の間で矛盾を生じ得る酸または熱処理などの過酷な方法によってBrdU抗体のためのアクセスを提供するために、DNAの変性を必要とすることです。代わりに、我々は異なるチミジンアナログ、EDUで活発に分裂する細胞を監視するために、同様のアプローチを利用しました。中性洗剤処理は新たに合成されたDNAにEDUにアクセスするための検出試薬を可能としてEDU検出は、過酷なDNA変性を必要としません。 EDUの方法は、より信頼性の高い一貫性および高スループット分析15のための潜在的であることが証明されています。
最後に、トンO Cdk1のミトコンドリアの基質を決定、我々は古典的な2次元ゲル電気泳動の高度なバージョンである2D-DIGEと呼ばれるプロテオミクスツールを使用していました。二次元電気泳動は、第二の最初の次元と分子量のそれらの等電点に応じてタンパク質を分離します。例えば、リン酸化などの翻訳後修飾は、タンパク質の等電点および分子量に影響を与えるので、2Dゲルは、異なる試料内のタンパク質のリン酸化状態の違いを検出することができます。タンパク質スポットの大きさ（面積および強度）は、複数のサンプル間の定量的な比較を可能にするタンパク質の発現レベルの変化します。この方法を使用して、我々は、変異ミトコンドリア標的Cdk1の発現細胞に対する野生型ではリン酸化タンパク質を区別することができました。野生型で示したが、ミトコンドリアを標的とした突然変異体Cdk1の準備に欠落していた特定のタンパク質スポットを単離し、質量分析により同定。
従来の2Dゲル中で、トリフェニルメタン染料、ゲル上のタンパク質を可視化するために使用されます。 2D-DIGEは、タンパク質電気泳動移動度への影響を最小限に抑えながら蛍光タンパク質のラベルを使用しています。異なるタンパク質サンプルは、単一のゲル16上の複数のサンプルの同時電気泳動を可能にする、一緒に混合し、同じゲルにより分離し、異なる蛍光色素で標識することができます。これは、ゲルベースのプロテオミクス研究における重要な問題であるゲルからゲルへの変化を、最小限に抑えることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
他の細胞内小器官宛のタンパク質と同様に、ミトコンドリアの標的タンパク質は、精巧なタンパク質のトランスロケーションと折り機21,22の支援を受けて細胞小器官にそれらを向ける彼らの一次または二次構造内ターゲティングシグナルを有しています。例えばCOX8としてのみミトコンドリア常駐タンパク質から得られた配列（MTS）を標的とするミトコンドリアは、ミトコンドリア…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.
Materials
| 32P ATP | PerkinElmer | BLU002001MC | |
| Anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11003 | Alexa-546 conjugated |
| Anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11029 | Alexa-488 conjugated |
| ATP | Research Organics | 1166A | For in vitro kinase assay |
| Cdk1 antibody | Cell Signaling Technology | 9112 | |
| Cdk1 kinase buffer | New England Biolabs | P6020S | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Life Technologies | C10337 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| COX IV antibody | Cell Signaling Technology | 4844S | For mitochondrial immunostaining |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-752 | |
| CyclinB1/Cdk1 enzyme complex | New England Biolabs | P6020S | Avoid freeze/thaw |
| CyDye DIGE Fluor Labeling Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25-8009-83 | |
| DIGE Gel and DIGE Buffer Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9480-26 AA | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 319937 | DMF |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 161-0611 | DTT |
| dNTP | EMD Millipore | 71004 | For site-directed mutagenesis |
| Dpn I enzyme | Stratagene | 200519-53 | For site-directed mutagenesis |
| Dry Strip cover fluid | GE Healthcare Life Sciences | 17-1335-01 | Used as mineral oil |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-03 | |
| EGTA | Acros Organics | 409910250 | |
| Eppendorf Vacufuge Concentrator | Fisher Scientific | 07-748-13 | Used as vacuum centrifuge concentrator |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | Anti-fade mounting solution |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | 649908 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| Histone H1 | Calbiochem | 382150 | For in vitro kinase assay |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For purifying DNA fragments from agarose gels |
| Immobiline DryStrip Gels | GE Healthcare Life Sciences | 18-1016-61 | IEF (isoelectric focusing) strips |
| Immobilized Glutathione | Thermo Scientific | 15160 | Glutathione-agarose beads |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | IAA |
| IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE Healthcare Life Sciences | 11-0033-64 | IPGphor strip holders |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside | RPI Corp | 156000-5.0 | IPTG |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L9783 | For cell lysis buffer |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent |
| Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | For CyDye labeling |
| Lysozyme | EMD Chemicals | 5960 | |
| Mitoctracker Red/Green | Invitrogen | M7512/M7514 | Mitochondrial fluorescent dyes |
| MOPS | EMD Chemicals | 6310 | |
| pEGFP-N1 | Clonetech | 6085-1 | GFP-expressing vector |
| Pfu | Stratagene | 600-255-52 | |
| pGEX-5X-1 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9545-53 | GST-expressing vector |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Shelton Scientific | IB01090 | PMSF |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040 | PBS |
| Spectra/Por 4 dialysis tubing | Spectrum Labs | 132700 | as porous membrane tubing for dialysis |
| Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain | Life Technologies | P-33300 | For staining phosphoproteins on 2D gels |
| Proteinase inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | For cell lysis buffer |
| QuikChange site-directed mutagenesis kit | Stratagene | 200519-5 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | MiniPrep Plasmid Isolation Kit |
| RO-3306 | Alexis Biochemicals | 270-463-M001 | Cdk1 inhibitor |
| Rotenone | MP Biomedicals | 150154 | Complex I inhibitor |
| Sodium carbonate | Fisher Scientific | S93359 | |
| Sodium chloride | EMD Chemicals | SX0420-5 | For cell lysis buffer |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | For cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Alfa Aesar | 33385 | For cell lysis buffer |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | L03425 | For cell lysis buffer |
| SpectraMax M2e | Molecular Devices | M2E | Microplate reader |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57-50-1 | |
| Tissue Grinder pestle | Kimble Chase | 885301-0007 | For mitochondria isolation |
| Tissue Grinder tube | Kimble Chase | 885303-0007 | For mitochondria isolation |
| Trichloroacetic acid solution | Sigma Aldrich | T0699 | TCA |
| Tris | MP Biomedicals | 103133 | |
| Triton-x-100 | Teknova | T1105 | |
| Trypsin | Calbiochem | 650211 | |
| Typhoon Imager | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Laser gel scanner fro 2D-DIGE |
| Ubiquinone | Sigma Aldrich | C7956 |
Referências
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