Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için
Summary
Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.
Abstract
Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.
Introduction
Memelilerde, hücre döngüsü ilerlemesinin siklinlerin ve sikline bağımlı kinazların (cdk'lar) 1 ile kontrol çok düzenli olaylar bağlıdır. Onun sitoplazmik, nükleer ve centrosomal lokalizasyon yoluyla, CyclinB1 / Cdk1 nükleer zarf arıza ve sentrozom ayırma 2 olarak mitoz farklı etkinlikleri senkronize edebiliyor. CyclinB1 / Cdk1 apoptoz 3 karşı mitoz hücreleri korur ve mitokondriyal fisyon, yeni kurulan yavru hücreye 4 mitokondri eşit dağılımı için kritik bir adım teşvik etmektedir.
Memeli hücre çoğalmasına olarak mitokondriyal ATP 5 çoklu alt birim kompleksi oluşur oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) makinelerini (elektron nakil zinciri) ile oluşturulur; kompleks I – Karmaşık V (CI-CV). Nikotinamid adenin dinükleotid (NADH): ubiquinone oksidoredüktazı ya da karmaşık I (CI), beş komplekslerinin 5 anlaşılan en az olur. karmaşık Cı45 alt birimden 14 onsists katalitik çekirdeğini oluşturur. Bir kez karmaşık bir kol matris ve iç zarı 6,7 gömülü diğer kol içine çıkıntılı bir L şeklinde bir yapı varsayar toplandı. Cl alt birimleri mutasyonlar mitokondriyal bozuklukların 8 çeşitli nedenidir. OXPHOS işlevsel olarak etkili bir CI genel mitokondriyal solunum 9, aynı zamanda, başarılı hücre döngüsü ilerlemesinin 10 için de gereklidir. Sağlıkta ve hastalıkta bu membran bağlı enzim kompleksinin işleyişini altında yatan mekanizmaları aydınlatmak yeni tanı yöntemleri ve gelişmiş tedavi stratejilerinin geliştirilmesini sağlayabilir. Yeni bir çalışmada, biz CyclinB1 / Cdk1 kompleksi hücrenin sırasında hücrelerin artan enerji ihtiyaçlarını karşılamak için (Gap 2) G2 / (Mitoz) M fazında mitokondri içine translocates ve potansiyel mitokondriyal enerji üretimini artırmak için CI alt birimleri fosforile bulduk döngüsü 11. Burada shoDeneysel prosedürler ve aksi çekirdek / sitoplazmik kinaz mitokondriyal translokasyon incelemek için kullanılabilir stratejileri Mitokondriyal substratlar yanı sıra örnek olarak CyclinB1 / CDK1 kullanarak mitokondriyal yerelleştirme fonksiyonel sonuçlarını wcase.
gerekli mitokondri özgü aşırı ekspresyonu ve bu kompleksin demonte çalışmaları istendiğinde CyclinB1 / Cdk1 kompleksi mitokondri içine translocates bulgu. Proteinlerin mitokondriye özgü ekspresyonunu elde etmek için, tek bir ilgili proteinin N-ucunda bir mitokondri hedefleme sekansı (MTS) ekleyin. Dizileri hedef Mitokondri normalde 12 ikamet mitokondri içine mitokondriyal proteinlerin sıralama izin verir. Bu CyclinB1 veya kırmızı flöresanlı etiketli insan sitokrom C oksidaz alt-birimi 8A (COX8) öncüsü elde edilen bir 87 baz mitokondri hedefleme sekansı kullanılabilir ve yeşil floresan proteini (GFP) içine klonladıkProtein (RFP) Cdk1 çerçeve içinde plazmaları ihtiva etiketli. Bu yöntem, özellikle nükleer havuz etkilemeden bu proteinlerin mitokondriyal ifadesini değiştirerek, bize mitokondri içine CyclinB1 ve CDK1 hedeflemesine izin. floresan bu proteinleri etiketleyerek, biz gerçek zamanlı olarak yerelleştirme izlemek için başardık. Benzer şekilde, bize özellikle CDK1 mitokondriyal ifade ve işlevleri yıkmak için izin RFP etiketli baskın negatif Cdk1 içeren bir plazmid içine MTS girmiştik. CDK1 gibi çift lokalizasyonu sahip kinazlar, mitokondri ve çekirdek fonksiyonları arasında ayırt etmek için gereklidir. Bu çift fonksiyonlu kinazlann, N-terminaline Mühendislik MTS kullanılabilir kolay ve etkili olan büyük bir strateji vardır.
Cdk1 bir hücre döngüsü kinaz olduğundan, Cdk1 mitokondri içine lokalize olduğunda hücre döngüsü ilerlemesini belirlemek için esastır. Bunu başarmak için, yeni bir yöntemii kullanmış olmasıd hücrelerde DNA içeriği izlemek için. Geleneksel yöntemler timidin yerine hücre döngüsünün S fazında yeni sentezlenmiş DNA içine içermektedir BrdU (bromodeoksiüridin), sentetik timidin analogu, kullanmayı içerir. Daha sonra aktif olarak kopyalayan DNA hücreler, anti-BrdU antikoru kullanılarak tespit edilebilir. Bu yöntemin bir dezavantajı, sonuç 13,14 arasında bir tutarsızlık ile sonuçlanabilir asit ya da ısı işlemi gibi sert yöntemlerle BrdU antikoru için erişim sağlamak için DNA denatürasyon gerektirmesidir. Alternatif olarak, biz farklı bir timidin analoğu, Edu ile aktif bölünen hücreleri izlemek için benzer bir yaklaşım kullanılmıştır. yumuşak deterjan işleme yeni sentezlenen DNA edu ulaşmak için saptama reajanı sağlayan şekilde edu algılama sert bir DNA denaturasyon gerektirmez. Edu yöntem daha güvenilir, tutarlı ve yüksek verimlilik analizi 15 potansiyeli olan kanıtlanmıştır.
Son olarak, to CDK1 mitokondriyal substratlar belirlemek, klasik iki boyutlu jel elektroforezi gelişmiş bir sürümüdür 2D-DIGE adında bir proteomik aracı kullanılır. İki boyutlu elektroforez ile birinci boyut ve molekül ağırlığı izoelektrik noktasına göre proteinleri ayıran. fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlar proteinlerin izoelektrik noktası ve moleküler ağırlık etkilediğinden, 2D jelleri farklı örnek içindeki proteinlerin fosforilasyon durumlarını arasındaki farkları belirleyebilir. protein boyutu (bölge ve yoğunluğu), birden çok örnekler arasında niceliksel karşılaştırılmasına izin veren, protein ekspresyon seviyesi ile değişiklik görür. Bu yöntemi kullanarak, mutant mitokondri hedefli Cdk1 eksprese eden hücreler karşı yabani tip fosforile proteinleri ayırt etmek mümkün oldu. Yabani tip gösterdi ama mitokondri hedefli mutant Cdk1 hazırlık eksik spesifik protein spotları izole edildi vekütle spektrometresi aracılığıyla belirledi.
Geleneksel 2D jelleri içinde, trifenilmetan boyalar jeli üzerinde proteinleri görselleştirmek için kullanılır. 2D-DIGE proteini elektroforetik mobilite üzerine minimal etkisi ile floresan protein etiketleri kullanır. Farklı protein numuneleri farklı floresan boyalar, karıştırılır ve tek bir jel 16 üzerinde birden çok numune eş elektroforez sağlayan aynı jeller ayrılmış ile etiketlenebilir. Bu jel bazlı proteomik çalışmalarda önemli bir problemdir jel için jel varyasyonları en aza indirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diğer hücre içi organellere için mukadder proteinler gibi, mitokondriyal hedeflenen proteinler ayrıntılı protein translocating ve katlama makineleri 21,22 yardımı ile organel onları yönlendirmek onların birincil veya ikincil yapı içinde hedefleme sinyalleri sahiptirler. Bu COX8 olarak sadece mitokondriyal yerleşik proteinlerden elde dizileri (MTS) hedefleme mitokondri, mitokondri 11,23,24 üzerine belirli proteinleri hedef için bir gen sekansının N-terminalinden eklenebilir. Burad…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.
Materials
| 32P ATP | PerkinElmer | BLU002001MC | |
| Anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11003 | Alexa-546 conjugated |
| Anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11029 | Alexa-488 conjugated |
| ATP | Research Organics | 1166A | For in vitro kinase assay |
| Cdk1 antibody | Cell Signaling Technology | 9112 | |
| Cdk1 kinase buffer | New England Biolabs | P6020S | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Life Technologies | C10337 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| COX IV antibody | Cell Signaling Technology | 4844S | For mitochondrial immunostaining |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-752 | |
| CyclinB1/Cdk1 enzyme complex | New England Biolabs | P6020S | Avoid freeze/thaw |
| CyDye DIGE Fluor Labeling Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25-8009-83 | |
| DIGE Gel and DIGE Buffer Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9480-26 AA | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 319937 | DMF |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 161-0611 | DTT |
| dNTP | EMD Millipore | 71004 | For site-directed mutagenesis |
| Dpn I enzyme | Stratagene | 200519-53 | For site-directed mutagenesis |
| Dry Strip cover fluid | GE Healthcare Life Sciences | 17-1335-01 | Used as mineral oil |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-03 | |
| EGTA | Acros Organics | 409910250 | |
| Eppendorf Vacufuge Concentrator | Fisher Scientific | 07-748-13 | Used as vacuum centrifuge concentrator |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | Anti-fade mounting solution |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | 649908 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| Histone H1 | Calbiochem | 382150 | For in vitro kinase assay |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For purifying DNA fragments from agarose gels |
| Immobiline DryStrip Gels | GE Healthcare Life Sciences | 18-1016-61 | IEF (isoelectric focusing) strips |
| Immobilized Glutathione | Thermo Scientific | 15160 | Glutathione-agarose beads |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | IAA |
| IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE Healthcare Life Sciences | 11-0033-64 | IPGphor strip holders |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside | RPI Corp | 156000-5.0 | IPTG |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L9783 | For cell lysis buffer |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent |
| Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | For CyDye labeling |
| Lysozyme | EMD Chemicals | 5960 | |
| Mitoctracker Red/Green | Invitrogen | M7512/M7514 | Mitochondrial fluorescent dyes |
| MOPS | EMD Chemicals | 6310 | |
| pEGFP-N1 | Clonetech | 6085-1 | GFP-expressing vector |
| Pfu | Stratagene | 600-255-52 | |
| pGEX-5X-1 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9545-53 | GST-expressing vector |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Shelton Scientific | IB01090 | PMSF |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040 | PBS |
| Spectra/Por 4 dialysis tubing | Spectrum Labs | 132700 | as porous membrane tubing for dialysis |
| Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain | Life Technologies | P-33300 | For staining phosphoproteins on 2D gels |
| Proteinase inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | For cell lysis buffer |
| QuikChange site-directed mutagenesis kit | Stratagene | 200519-5 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | MiniPrep Plasmid Isolation Kit |
| RO-3306 | Alexis Biochemicals | 270-463-M001 | Cdk1 inhibitor |
| Rotenone | MP Biomedicals | 150154 | Complex I inhibitor |
| Sodium carbonate | Fisher Scientific | S93359 | |
| Sodium chloride | EMD Chemicals | SX0420-5 | For cell lysis buffer |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | For cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Alfa Aesar | 33385 | For cell lysis buffer |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | L03425 | For cell lysis buffer |
| SpectraMax M2e | Molecular Devices | M2E | Microplate reader |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57-50-1 | |
| Tissue Grinder pestle | Kimble Chase | 885301-0007 | For mitochondria isolation |
| Tissue Grinder tube | Kimble Chase | 885303-0007 | For mitochondria isolation |
| Trichloroacetic acid solution | Sigma Aldrich | T0699 | TCA |
| Tris | MP Biomedicals | 103133 | |
| Triton-x-100 | Teknova | T1105 | |
| Trypsin | Calbiochem | 650211 | |
| Typhoon Imager | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Laser gel scanner fro 2D-DIGE |
| Ubiquinone | Sigma Aldrich | C7956 |
Referências
- Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
- Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
- Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
- Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
- Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
- Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
- Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
- Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
- Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
- Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
- Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
- Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
- Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3′-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
- Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic ‘click’ reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
- Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
- Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25 (2009).
- Davies, D., Macey, M. G. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. , 257-276 (2007).
- van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
- Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
- Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
- Karniely, S., Pines, O. Single translation–dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
- Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
- Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341 (2010).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
- Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
- Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).
