Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1
Summary
Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.
Abstract
Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.
Introduction
En los mamíferos, la progresión del ciclo celular depende de eventos altamente ordenadas controlados por ciclinas y quinasas dependientes de ciclina (CDK) 1. A través de su citoplasmática, nuclear, y la localización centrosómicas, CyclinB1 / Cdk1 es capaz de sincronizar diferentes eventos en la mitosis tales como rotura de la envuelta nuclear y la separación del centrosoma 2. CyclinB1 / Cdk1 protege a las células contra la apoptosis mitótico 3 y promueve la fisión mitocondrial, un paso crítico para una distribución equitativa de las mitocondrias de las células hijas recién formadas 4.
En la proliferación de células de mamíferos, mitocondrial ATP se genera a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) maquinaria (cadena de transporte de electrones), que se compone de 5 complejos de múltiples subunidades; complejo I – complejo V (IC-CV). Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH): ubiquinona oxidorreductasa o complejo I (CI) es la más grande y menos comprendido de los cinco complejos 5. El complejo consists de 45 subunidades, 14 de los cuales forman el núcleo catalítico. Una vez montado, el complejo adopta una estructura en forma de L con un brazo que sobresale en la matriz y el otro brazo incrustado en el 6,7 membrana interna. Las mutaciones en las subunidades de CI son la causa de una variedad de trastornos mitocondriales 8. Se requiere un CI funcionalmente eficiente en la fosforilación oxidativa, no sólo para la respiración mitocondrial general 9, sino también para la progresión del ciclo celular con éxito 10. Desentrañar los mecanismos que subyacen al funcionamiento de este complejo enzimático unido a la membrana en la salud y la enfermedad podría permitir el desarrollo de nuevos procedimientos de diagnóstico y estrategias terapéuticas avanzadas. En un estudio reciente, se ha encontrado que el complejo CyclinB1 / Cdk1 se transloca a la mitocondria en el G2 (mitosis) fase M (Gap 2) / y fosforila subunidades IC para mejorar la producción de energía mitocondrial, potencialmente, para compensar el aumento de las necesidades de energía de las células durante celular ciclo de 11. Aquí nos Showcase procedimientos experimentales y las estrategias que se pueden utilizar para estudiar la translocación mitocondrial de quinasas de otro modo núcleo / citoplasma, sus sustratos mitocondrial, así como consecuencias funcionales de su localización mitocondrial usando CyclinB1 / Cdk1 como un ejemplo.
El hallazgo de que el complejo CyclinB1 / Cdk1 se transloca a la mitocondria cuando sea necesario se le solicite los estudios de sobreexpresión y desmontables de este complejo-mitocondria específica. Para conseguir la expresión-mitocondria específico de proteínas, se puede añadir una secuencia de mitocondrias de orientación (MTS) en el N-terminal de la proteína de interés. Las mitocondrias de orientación secuencias permiten la clasificación de las proteínas mitocondriales en las mitocondrias, donde residen normalmente 12. Hemos utilizado una secuencia dirigida a las mitocondrias 87 de base procedentes del precursor de la citocromo oxidasa subunidad humana c 8A (COX8) y se clonó en Green Fluorescent Protein (GFP)-etiquetados CyclinB1 o rojo fluorescenteProteína (RFP)-etiquetados Cdk1 que contiene plásmidos en el marco. Este método nos ha permitido también identificar los CyclinB1 y Cdk1 en la mitocondria, cambiando específicamente la expresión mitocondrial de estas proteínas sin afectar a su piscina nuclear. Mediante el etiquetado con fluorescencia estas proteínas, hemos sido capaces de controlar su localización en tiempo real. Del mismo modo, hemos introducido MTS en un plásmido que contiene RFP-etiquetados dominante Cdk1 negativo, lo que permitió a la detonación específicamente por la expresión mitocondrial y funciones de Cdk1. Es esencial distinguir entre las funciones mitocondriales y nucleares de las quinasas que tienen localizaciones duales como Cdk1. Ingeniería MTS en el N-terminal de estas quinasas duales funcionales ofrece una gran estrategia que es fácil de ser empleado y eficaz.
Desde Cdk1 es un ciclo celular quinasa, es fundamental para determinar la progresión del ciclo celular cuando Cdk1 se localiza en las mitocondrias. Para lograr esto, hemos utilizado un nuevo method para supervisar el contenido de ADN en las células. Los métodos tradicionales incluyen el uso de BrdU (bromodesoxiuridina), un análogo de timidina sintético, que incorpora en el ADN recién sintetizado durante la fase S del ciclo celular para sustituir timidina. A continuación, las células que están replicando activamente su ADN se pueden detectar usando anticuerpos anti-BrdU. Una desventaja de este método es que requiere la desnaturalización del ADN para proporcionar acceso para el anticuerpo BrdU por métodos agresivos como tratamiento con ácido o calor, que pueden resultar en inconsistencia entre los resultados de 13,14. Alternativamente, se utilizó un enfoque similar para monitorear las células que se dividen activamente con un análogo de la timidina diferente, edu. EdU detección no requiere desnaturalización del ADN duras como tratamiento detergente suave permite que el reactivo de detección para acceder a la UDE en el ADN recién sintetizado. El método EdU ha demostrado ser más fiable, consistente y con un potencial de análisis de alto rendimiento 15.
Finalmente, to determinar los sustratos mitocondriales de Cdk1, se utilizó una herramienta de proteómica llamado 2D-DIGE, que es una versión avanzada de la electroforesis bidimensional en gel clásico. Dos electroforesis dimensional separa las proteínas en función de su punto isoeléctrico en la primera dimensión y el peso molecular en el segundo. Desde modificaciones post-traduccionales tales como fosforilación afectan el punto isoeléctrico y el peso molecular de las proteínas, geles 2D pueden detectar las diferencias entre los estados de fosforilación de las proteínas dentro de las diferentes muestras. El tamaño (área e intensidad) de la proteína de spots de cambios con el nivel de expresión de las proteínas, lo que permite la comparación cuantitativa entre múltiples muestras. Usando este método, hemos sido capaces de diferenciar las proteínas fosforiladas en el tipo salvaje frente a las células que expresan Cdk1 mitocondrias orientada mutantes. Se aislaron las manchas de proteínas específicas que mostraron en el tipo salvaje, pero faltaban en el mutante preparación Cdk1 mitocondrias y las orientadas poridentificado mediante espectrometría de masas.
En los geles en 2D tradicionales, colorantes de trifenilmetano se utilizan para visualizar las proteínas en el gel. 2D-DIGE utiliza etiquetas de la proteína fluorescente con un efecto mínimo sobre la movilidad electroforética de proteínas. Diferentes muestras de proteína pueden ser marcadas con diferentes colorantes fluorescentes, mezclados entre sí y separadas por los geles idénticos, lo que permite la co-electroforesis de múltiples muestras en un solo gel 16. Esto minimiza las variaciones de gel a gel, lo cual es un problema crítico en estudios de proteómica a base de gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al igual que las proteínas destinadas a otros orgánulos subcelulares, las proteínas mitocondriales dirigida poseen señales de orientación dentro de su estructura primaria o secundaria que los dirigen hacia el orgánulo con la ayuda de elaborada de translocación de proteínas y plegadoras 21,22. Las mitocondrias de orientación secuencias (MTS) obtenidos a partir de las proteínas residentes exclusivamente mitocondriales tales como COX8 se pueden añadir al extremo N-terminal de cualquier secuencia de ge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.
Materials
| 32P ATP | PerkinElmer | BLU002001MC | |
| Anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11003 | Alexa-546 conjugated |
| Anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11029 | Alexa-488 conjugated |
| ATP | Research Organics | 1166A | For in vitro kinase assay |
| Cdk1 antibody | Cell Signaling Technology | 9112 | |
| Cdk1 kinase buffer | New England Biolabs | P6020S | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Life Technologies | C10337 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| COX IV antibody | Cell Signaling Technology | 4844S | For mitochondrial immunostaining |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-752 | |
| CyclinB1/Cdk1 enzyme complex | New England Biolabs | P6020S | Avoid freeze/thaw |
| CyDye DIGE Fluor Labeling Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25-8009-83 | |
| DIGE Gel and DIGE Buffer Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9480-26 AA | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 319937 | DMF |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 161-0611 | DTT |
| dNTP | EMD Millipore | 71004 | For site-directed mutagenesis |
| Dpn I enzyme | Stratagene | 200519-53 | For site-directed mutagenesis |
| Dry Strip cover fluid | GE Healthcare Life Sciences | 17-1335-01 | Used as mineral oil |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-03 | |
| EGTA | Acros Organics | 409910250 | |
| Eppendorf Vacufuge Concentrator | Fisher Scientific | 07-748-13 | Used as vacuum centrifuge concentrator |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | Anti-fade mounting solution |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | 649908 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| Histone H1 | Calbiochem | 382150 | For in vitro kinase assay |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For purifying DNA fragments from agarose gels |
| Immobiline DryStrip Gels | GE Healthcare Life Sciences | 18-1016-61 | IEF (isoelectric focusing) strips |
| Immobilized Glutathione | Thermo Scientific | 15160 | Glutathione-agarose beads |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | IAA |
| IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE Healthcare Life Sciences | 11-0033-64 | IPGphor strip holders |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside | RPI Corp | 156000-5.0 | IPTG |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L9783 | For cell lysis buffer |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent |
| Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | For CyDye labeling |
| Lysozyme | EMD Chemicals | 5960 | |
| Mitoctracker Red/Green | Invitrogen | M7512/M7514 | Mitochondrial fluorescent dyes |
| MOPS | EMD Chemicals | 6310 | |
| pEGFP-N1 | Clonetech | 6085-1 | GFP-expressing vector |
| Pfu | Stratagene | 600-255-52 | |
| pGEX-5X-1 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9545-53 | GST-expressing vector |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Shelton Scientific | IB01090 | PMSF |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040 | PBS |
| Spectra/Por 4 dialysis tubing | Spectrum Labs | 132700 | as porous membrane tubing for dialysis |
| Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain | Life Technologies | P-33300 | For staining phosphoproteins on 2D gels |
| Proteinase inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | For cell lysis buffer |
| QuikChange site-directed mutagenesis kit | Stratagene | 200519-5 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | MiniPrep Plasmid Isolation Kit |
| RO-3306 | Alexis Biochemicals | 270-463-M001 | Cdk1 inhibitor |
| Rotenone | MP Biomedicals | 150154 | Complex I inhibitor |
| Sodium carbonate | Fisher Scientific | S93359 | |
| Sodium chloride | EMD Chemicals | SX0420-5 | For cell lysis buffer |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | For cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Alfa Aesar | 33385 | For cell lysis buffer |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | L03425 | For cell lysis buffer |
| SpectraMax M2e | Molecular Devices | M2E | Microplate reader |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57-50-1 | |
| Tissue Grinder pestle | Kimble Chase | 885301-0007 | For mitochondria isolation |
| Tissue Grinder tube | Kimble Chase | 885303-0007 | For mitochondria isolation |
| Trichloroacetic acid solution | Sigma Aldrich | T0699 | TCA |
| Tris | MP Biomedicals | 103133 | |
| Triton-x-100 | Teknova | T1105 | |
| Trypsin | Calbiochem | 650211 | |
| Typhoon Imager | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Laser gel scanner fro 2D-DIGE |
| Ubiquinone | Sigma Aldrich | C7956 |
Referências
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