Экспериментальные подходы к изучению Митохондриальная локализации и функции цикла ядерных клеток киназа, CDK1
Summary
Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.
Abstract
Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.
Introduction
У млекопитающих, прогрессию клеточного цикла зависит от высокоупорядоченных событий , контролируемых циклинов и циклин-зависимых киназ (CDKS) 1. Благодаря его цитоплазматическом, ядерной и центросомной локализации, CyclinB1 / Cdk1 способен синхронизировать различные события в митозе , таких как пробой ядерной оболочки и центросом разделения 2. CyclinB1 / Cdk1 защищает митотических клеток от апоптоза 3 и способствует митохондриальной деления, критический шаг для равномерного распределения митохондрий вновь образованных клеток дочь 4.
В пролиферирующих клетках млекопитающих митохондриальной АТФ генерируется с помощью окислительного фосфорилирования (OXPHOS) машины (цепи переноса электронов), который состоит из 5 из множества субъединиц комплексов; Комплекс I – комплекс V (CI-CV). Никотинамидадениндинуклеотид (NADH): убихинон оксидоредуктазы или комплекс I (CI) является самым крупным и наименее изученной из пяти комплексов 5. Комплекс сonsists из 45 субъединиц, 14 из которых образуют каталитическую сердцевину. После сборки, комплекс предполагает L-образную конструкцию с одной рукой , выступающая в матрице , а другой рукой внедренного во внутреннюю 6,7 мембраны. Мутации в CI субъединиц являются причиной множества митохондриальных нарушений 8. Функционально эффективность CI в OXPHOS требуется не только для общего митохондриального дыхания 9, но и для прогрессии цикла успешно клеток 10. Unravelling механизмы, лежащие в основе функционирования этой мембраносвязанного ферментного комплекса в отношении здоровья и болезни может способствовать разработке новых диагностических процедур и передовых терапевтических стратегий. В недавнем исследовании мы обнаружили, что CyclinB1 / комплекс Cdk1 транслоцируется в митохондрии в G2 (митоза) M фазы (Gap 2) / и фосфорилирует CI субъединиц для расширения производства митохондриальной энергии, потенциально, чтобы компенсировать повышенные энергетические потребности клеток во время клеточного цикл 11. Здесь мы шоwcase экспериментальных процедур и стратегий, которые могут быть использованы для изучения митохондриальной транслокацию в противном случае ядерных / цитоплазматические киназ, их митохондриальных субстратов, а также функциональные последствия их митохондриальной локализации с использованием CyclinB1 / Cdk1 в качестве примера.
К выводу, что CyclinB1 / комплекс Cdk1 транслоцируется в митохондрии при необходимости побудила исследования митохондриальной специфических оверэкспрессии и нокдаун этого комплекса. Для достижения митохондрии специфических экспрессию белков, можно добавить последовательность митохондрии ориентации (MTS) в N-конце белка, представляющего интерес. Митохондрии таргетингом последовательности позволяют сортировку митохондриальных белков в митохондрии , где они обычно проживают 12. Мы использовали таргетирования последовательность 87 оснований митохондрии, полученный из предшественника человеческого цитохром с оксидазы субъединиц 8А (COX8) и клонируют его в зеленый флуоресцентный белок (GFP) -tagged CyclinB1 или красный флуоресцентныйПротеин (ЗП) -tagged Cdk1, содержащих плазмид в кадре. Этот метод позволил нам целевой CyclinB1 и Cdk1 в митохондрии, в частности, изменение митохондриальной экспрессии этих белков, не затрагивая их ядерный пул. По флуоресцентно мечения эти белки, мы были в состоянии контролировать их локализацию в режиме реального времени. Кроме того, мы ввели MTS в плазмиду, содержащую RFP-меченый доминирующим отрицательным Cdk1, что позволило нам конкретно сбить митохондриальную экспрессию и функции Cdk1. Важно различать митохондриальных и ядерных функций киназ, которые имеют двойное локализаций как Cdk1. Инжиниринг МТС в N-терминала этих двойных функциональных киназ предлагает большую стратегию, которая легко использоваться и эффективно.
Поскольку Cdk1 является клеточного цикла киназы, она имеет фундаментальное значение для определения прогрессии клеточного цикла, когда Cdk1 локализована в митохондриях. Для достижения этой цели мы использовали новую метоd контролировать содержание ДНК в клетках. Традиционные методы включают использование BrdU (бромдеоксиуридина), синтетический аналог тимидина, который встраивается в вновь синтезированной ДНК в фазе S клеточного цикла, чтобы заменить тимидина. Затем клетки, которые активно дублирующие их ДНК могут быть обнаружены с помощью анти-BrdU антителами. Одним из недостатков этого способа состоит в том , что она требует денатурации ДНК , чтобы обеспечить доступ к антителу BrdU с помощью жестких методов , таких как кислоты или термической обработки, что может привести к несоответствию между результатами 13,14. В качестве альтернативы, мы использовали аналогичный подход для наблюдения за активно делящиеся клетки с различным аналоговым тимидина, Эду. Обнаружение Эду не требует резкой денатурации ДНК, как мягкая обработка моющее средство позволяет реагент обнаружения для доступа к Эду во вновь синтезированной ДНК. Метод Эду оказался более надежным, последовательным и с потенциалом для анализа с высокой пропускной способностью 15.
И, наконец, тO определяют митохондриальных субстратов Cdk1, мы использовали инструмент под названием протеомики 2D-ПГЛП, который является продвинутой версией классического двухмерным электрофорезом в геле. Двумерный электрофорез разделяет белки по их изоэлектрической точке в первом измерении и молекулярной массой во второй. Так как пост-трансляционной модификации, такие как фосфорилирование влияет на изоэлектрической точки и молекулярную массу белков, 2D гели могут обнаружить разницу между фосфорилирования статусов белков в составе различных образцов. Размер (площадь и интенсивность) белка видит изменения с уровнем экспрессии белков, что позволяет количественное сравнение между несколькими образцами. Используя этот метод, мы смогли дифференцировать фосфорилированные белки дикого типа в сравнении с мутантным митохондрии, ориентированных CDK1 экспрессирующих клеток. Специфические белковые пятна, которые показали в дикого типа, но отсутствовавшие в митохондриях таргетингом мутантного препарата CDK1 были выделены иидентифицировали с помощью масс-спектрометрии.
В традиционных 2D-гелей, Трифенилметановые красители используются для визуализации белков на геле. 2D-ПГЛП использует флуоресцентный белок этикетки с минимальным влиянием на электрофоретической подвижности белка. Различные образцы белка могут быть помечены различными флуоресцентными красителями, смешивались и разделенных одинаковыми гелями, что позволяет совместное электрофорез нескольких образцов на одном геле 16. Это минимизирует гель-на-гель вариаций, что является серьезной проблемой в гель на основе протеомики исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как и белки , предназначенные для других внутриклеточных органелл, митохондриальные белки обладают мишенью таргетингом сигналы в их первичной или вторичной структуры , которые направляют их органеллы с помощью сложного белка транслокации и складных машин 21,22. Митохондрии нацел?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.
Materials
| 32P ATP | PerkinElmer | BLU002001MC | |
| Anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11003 | Alexa-546 conjugated |
| Anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11029 | Alexa-488 conjugated |
| ATP | Research Organics | 1166A | For in vitro kinase assay |
| Cdk1 antibody | Cell Signaling Technology | 9112 | |
| Cdk1 kinase buffer | New England Biolabs | P6020S | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Life Technologies | C10337 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| COX IV antibody | Cell Signaling Technology | 4844S | For mitochondrial immunostaining |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-752 | |
| CyclinB1/Cdk1 enzyme complex | New England Biolabs | P6020S | Avoid freeze/thaw |
| CyDye DIGE Fluor Labeling Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25-8009-83 | |
| DIGE Gel and DIGE Buffer Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9480-26 AA | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 319937 | DMF |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 161-0611 | DTT |
| dNTP | EMD Millipore | 71004 | For site-directed mutagenesis |
| Dpn I enzyme | Stratagene | 200519-53 | For site-directed mutagenesis |
| Dry Strip cover fluid | GE Healthcare Life Sciences | 17-1335-01 | Used as mineral oil |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-03 | |
| EGTA | Acros Organics | 409910250 | |
| Eppendorf Vacufuge Concentrator | Fisher Scientific | 07-748-13 | Used as vacuum centrifuge concentrator |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | Anti-fade mounting solution |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | 649908 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| Histone H1 | Calbiochem | 382150 | For in vitro kinase assay |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For purifying DNA fragments from agarose gels |
| Immobiline DryStrip Gels | GE Healthcare Life Sciences | 18-1016-61 | IEF (isoelectric focusing) strips |
| Immobilized Glutathione | Thermo Scientific | 15160 | Glutathione-agarose beads |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | IAA |
| IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE Healthcare Life Sciences | 11-0033-64 | IPGphor strip holders |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside | RPI Corp | 156000-5.0 | IPTG |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L9783 | For cell lysis buffer |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent |
| Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | For CyDye labeling |
| Lysozyme | EMD Chemicals | 5960 | |
| Mitoctracker Red/Green | Invitrogen | M7512/M7514 | Mitochondrial fluorescent dyes |
| MOPS | EMD Chemicals | 6310 | |
| pEGFP-N1 | Clonetech | 6085-1 | GFP-expressing vector |
| Pfu | Stratagene | 600-255-52 | |
| pGEX-5X-1 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9545-53 | GST-expressing vector |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Shelton Scientific | IB01090 | PMSF |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040 | PBS |
| Spectra/Por 4 dialysis tubing | Spectrum Labs | 132700 | as porous membrane tubing for dialysis |
| Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain | Life Technologies | P-33300 | For staining phosphoproteins on 2D gels |
| Proteinase inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | For cell lysis buffer |
| QuikChange site-directed mutagenesis kit | Stratagene | 200519-5 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | MiniPrep Plasmid Isolation Kit |
| RO-3306 | Alexis Biochemicals | 270-463-M001 | Cdk1 inhibitor |
| Rotenone | MP Biomedicals | 150154 | Complex I inhibitor |
| Sodium carbonate | Fisher Scientific | S93359 | |
| Sodium chloride | EMD Chemicals | SX0420-5 | For cell lysis buffer |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | For cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Alfa Aesar | 33385 | For cell lysis buffer |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | L03425 | For cell lysis buffer |
| SpectraMax M2e | Molecular Devices | M2E | Microplate reader |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57-50-1 | |
| Tissue Grinder pestle | Kimble Chase | 885301-0007 | For mitochondria isolation |
| Tissue Grinder tube | Kimble Chase | 885303-0007 | For mitochondria isolation |
| Trichloroacetic acid solution | Sigma Aldrich | T0699 | TCA |
| Tris | MP Biomedicals | 103133 | |
| Triton-x-100 | Teknova | T1105 | |
| Trypsin | Calbiochem | 650211 | |
| Typhoon Imager | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Laser gel scanner fro 2D-DIGE |
| Ubiquinone | Sigma Aldrich | C7956 |
Referências
- Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
- Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
- Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
- Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
- Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
- Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
- Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
- Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
- Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
- Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
- Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
- Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
- Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3′-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
- Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic ‘click’ reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
- Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
- Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25 (2009).
- Davies, D., Macey, M. G. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. , 257-276 (2007).
- van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
- Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
- Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
- Karniely, S., Pines, O. Single translation–dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
- Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
- Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341 (2010).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
- Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
- Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).
