Quantification des filamenteuses Actine (F-actine) punctas chez le rat neurones corticaux
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
Filamenteux protéine d'actine (actine F) joue un rôle majeur dans spinogenèse, la plasticité synaptique et la stabilité synaptique. L'évolution des structures riches dendritiques F-actine suggèrent des modifications dans l'intégrité synaptique et la connectivité. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la culture de rat primaires neurones corticaux, phalloïdine coloration pour puncta F-actine, et les techniques de quantification ultérieures. Tout d'abord, le cortex frontal des embryons de rat E18 sont dissociées dans une culture de cellules de faible densité, alors les neurones cultivés in vitro pendant au moins 12-14 jours. Après un traitement expérimental, les neurones corticaux sont colorées avec AlexaFluor 488 phalloïdine (pour marquer les points lacrymaux F-actine dendritique) et associée aux microtubules protein 2 (MAP2; pour valider les cellules neuronales et l'intégrité dendritique). Enfin, un logiciel spécialisé est utilisé pour analyser et quantifier les dendrites neuronales choisis au hasard. F-actine structures riches sont identifiés sur le deuxième ordre branches dendritiques (gamme 25-75 et de la longueur# 181; m) avec immunofluorescence MAP2 continue. Le protocole présenté ici sera une méthode utile pour étudier l'évolution des structures des synapses dendritiques subséquentes à des traitements expérimentaux.
Introduction
L'objectif principal de cette étude est de développer une méthode fiable de mesure (estimation) de l'intégrité synaptique du réseau dendritique neuronale. Nous décrivons ici la quantification des points lacrymaux F-actine dans rat primaire des neurones en culture en utilisant une combinaison de phalloïdine coloration et immunocytochimique (ICC) détection des dendrites avec une analyse ultérieure en utilisant (NIS-Elements) spécialisée logiciel.
Phallotoxins marquées ont une affinité similaire pour les grands et petits filaments (F-actine), mais ne se lient pas à monomère actine globulaire (G-actine), contrairement à certains anticorps d'actine 1. La liaison non spécifique de phalloïdine est négligeable, offrant ainsi fond minimal lors de l'imagerie cellulaire. Phalloïdine est beaucoup plus faible que les anticorps qui sont généralement utilisées pour marquer les protéines cellulaires par microscopie à fluorescence, ce qui permet beaucoup plus intense marquage de l'actine F par la phalloïdine. Ainsi, des images détaillées de localisation F-actine dans les neurones peuvent êtreobtenue grâce à l'utilisation de phalloïdine marquée.
Phalloïdine (F-actine) coloration des dendrites neuronales génère discrets "points chauds" ou brillant "puncta», qui représentent une variété de structures dendritiques, y compris les épines matures, synapses non épineuses 2 et épines immatures. Épines immatures comprennent filopodes minces et certaines formes de correctif morphologie, et peuvent représenter l'ouverture d'spinogenèse 3. Épines immatures et des correctifs non-épineux manquent PSD95 4. Evolution de la production de plomb F-actine des variations ultérieures non seulement épines mais aussi des structures dendritiques supplémentaires, faisant ainsi phalloïdine un outil important pour étudier l'intégrité synaptodendritic 5-7. En général, le nombre de phalloïdine-positive (F-actine) puncta reflètent un équilibre entre les synapses actives (excitateurs et inhibiteurs), dynamique de l'actine et de la stabilité de la synapse 8.
Bien qu'il soit important d'étudier spécifique types de synapses (c.-à épines excitateurs), lorsque la cible d'un traitement est inconnue, il faut d'abord évaluer l'intégrité générale d'une variété de structures dendritiques. Depuis F-actine est une composante majeure des épines dendritiques et d'autres structures, y compris les synapses inhibitrices, un nombre altéré de puncta F-actine peut indiquer un synaptopathy. Cette synaptopathy peut alors être étudiée plus pour des modifications plus spécifiques. Notre méthode de quantification pour détecter plusieurs types synaptiques / structures donne une estimation globale des modifications synaptiques dendritiques (augmentations et diminutions) suivantes divers traitements expérimentaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons la culture de neurones corticaux de rat à faible densité dans les plats à fond de verre de 35 mm, qui nous permet d'identifier les dendrites des neurones individuels. Ensuite, nous utilisons phalloïdine et MAP2 coloration pour détecter les changements dendritiques. Ensuite, nous avons utilisé un logiciel spécialisé pour quantifier les changements dans puncta F-actine.
Pour déterminer les changements dans puncta F-actine l'ensemble du résea…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
Referências
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