La quantificazione di filamentosa Actina (F-actina) Puncta nel ratto neuroni corticali
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
Filamentosa proteine actina (F-actina) svolge un ruolo importante nella spinogenesis, plasticità sinaptica, e la stabilità sinaptica. Cambiamenti nelle strutture ricche dendritiche F-actina suggeriscono alterazioni nella integrità sinaptica e la connettività. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la coltura di ratto primario neuroni corticali, Colorazione falloidina per puncta F-actina, e successive tecniche di quantificazione. Innanzitutto, la corteccia frontale di embrioni di ratto E18 sono dissociato in coltura cellulare a bassa densità, allora i neuroni coltivati in vitro per almeno 12-14 giorni. Dopo il trattamento sperimentale, i neuroni corticali sono macchiati con AlexaFluor 488 falloidina (per etichettare il puncta F-actina dendritiche) e map2 (MAP2, per convalidare le cellule neuronali e l'integrità dendritiche). Infine, il software specializzato è utilizzato per analizzare e quantificare dendriti neuronali selezionati in modo casuale. F-actina strutture ricche sono identificati sul secondo ordine rami dendritiche (range 25-75 lunghezza &# 181; m) con continui immunofluorescenza MAP2. Il protocollo presentato qui sarà un metodo utile per studiare i cambiamenti nelle strutture sinapsi dendritiche successivi trattamenti sperimentali.
Introduction
L'obiettivo primario di questo studio è quello di sviluppare un metodo affidabile di misura (stima) di integrità sinaptica della rete dendritica neuronale. Qui si descrive la quantificazione di puncta F-actina in primari di ratto neuroni in coltura utilizzando una combinazione di falloidina colorazione e rilevamento immunocitochimica (ICC) di dendriti con successiva analisi utilizzando software specializzati (NIS-Elements).
Phallotoxins etichettati hanno un'affinità simile per grandi e piccoli filamenti (F-actina), ma non si legano al monomero globulare actina (G-actina), a differenza di alcuni anticorpi actina 1. Legame non specifico di falloidina è trascurabile, fornendo in tal modo sfondo minima durante l'imaging cellulare. Falloidina è molto più piccolo di anticorpi che viene in genere utilizzato per etichettare proteine cellulari per microscopia a fluorescenza, che consente molto più intenso etichettatura di F-actina by falloidina. Così, immagini dettagliate di localizzazione F-actina nei neuroni possono essereottenuto attraverso l'uso di etichetta falloidina.
Falloidina (F-actina) colorazione dei dendriti neuronali genera discreti "punti caldi" o "puncta" luminosa, che rappresentano una varietà di strutture dendritiche, tra cui spine mature, le sinapsi non spinosi 2 e spine immature. Spine immature includono filopodi sottili e alcune forme di patch di morfologia, e possono rappresentare l'avvio di spinogenesis 3. Spine immature e patch non spinosi mancano PSD95 4. Cambiamenti nella produzione di piombo F-actina alle successive variazioni non solo spine ma anche strutture dendritiche aggiuntivi, rendendo così falloidina uno strumento importante per indagare l'integrità synaptodendritic 5-7. In generale, il numero di falloidina-positivi (F-actina) puncta riflettono un equilibrio tra le sinapsi attive (eccitatori e inibitori), le dinamiche di actina e la stabilità sinapsi 8.
Anche se è importante studiare specifica tipi di sinapsi (cioè, spine eccitatorie), quando la destinazione di un trattamento non è nota, è necessario stimare prima l'integrità generale di una varietà di strutture dendritiche. Dal momento che F-actina è una componente importante di spine dendritiche e altre strutture, tra cui sinapsi inibitorie, un numero alterato di puncta F-actina può indicare una synaptopathy. Questo synaptopathy può quindi essere studiata ulteriormente per le modifiche più specifiche. Il nostro metodo di quantificazione per il rilevamento di più sinaptici tipi / strutture produce una stima complessiva del dendritiche alterazioni sinaptiche (aumenti e le diminuzioni) a seguito di vari trattamenti sperimentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, si descrive la coltura neuroni corticali di ratto a bassa densità in piatti con fondo di vetro da 35 mm, che ci permette di identificare dendriti dei singoli neuroni. Avanti, usiamo falloidina e MAP2 colorazione per rilevare i cambiamenti dendritiche. Poi, abbiamo utilizzato un software specializzato per quantificare i cambiamenti in puncta F-actina.
Per determinare le variazioni di puncta F-actina tutta la rete neuronale di un singolo neurone deve essere chiaramente v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
Referências
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