Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
(F-aktin) İpliksi aktin proteini spinogenesis, sinaptik plastisite ve sinaptik stabilitesinde önemli bir rol oynar. dendritik F-aktin zengin yapılardaki değişiklikler sinaptik bütünlük ve bağlantı değişiklikleri göstermektedir. Burada F-aktin puncta ve sonraki ölçümü teknikleri için birincil sıçan kortikal nöronların, Phalloidin boyama kültürü için ayrıntılı bir protokol sağlar. İlk olarak, E18 fare embriyonlarının frontal korteks, daha sonra, düşük yoğunluklu, hücre kültürü içine en az 12-14 gün boyunca in vitro yetiştirilen nöronlar ayrışmış. Deneysel tedaviden sonra, kortikal nöronlar AlexaFluor 488 falloidinle boyanır ve mikrotübül-ilişkili protein 2 (dendritik F-aktin puncta etiket) (MAP2; nöronal hücreleri ve dendritik bütünlüğünü doğrulamak için). Son olarak, özel yazılım analiz ve rastgele seçilen nöronal dendrite ölçmek için kullanılır. F-aktin zengin yapılar ikinci mertebe dendritik dalları (uzunluk aralığı 25-75 ve tespit edilir# 181; sürekli map2 immünofloresan ile m). Burada sunulan protokol deneysel tedaviler sonrasında dendritik sinaps yapılarında değişiklikler araştırmak için faydalı bir yöntem olacaktır.
Introduction
Bu çalışmanın temel amacı, nöronal dendritik ağın sinaptik bütünlüğünün ölçümü (tahmini) güvenilir bir yöntem geliştirmektir. Burada Phalloidin boyama ve uzman (NIS-Elemanları) yazılımı kullanılarak takip eden analizi ile dendritler immunositokimyasal (ICC) taramadan oluşan bir kombinasyon kullanılarak primer fare kültürlenmiş nöronlar F-aktin puncta ölçülmesini açıklar.
Etiketli phallotoxins büyük ve küçük ipliklerin (F-aktin) için benzer bir yakınlığa sahip fakat bazı aktin antikor 1 farklı olarak, monomerik küresel aktin (G-aktin) bağlanmaz. Phalloidin bağlayıcı Nonspesifik böylece hücresel görüntüleme sırasında en az bir arka plan sağlayarak, ihmal edilebilir düzeydedir. Phalloidin genellikle Phalloidin F-aktin çok daha yoğun etiketleme sağlar flüoresan mikroskopi için hücresel proteinleri etiketlemek için kullanılacak antikorlar çok daha küçüktür. Böylece, nöronlarda F-aktin lokalizasyonu detaylı görüntüler olabilirişaretlenmiş falloidinle kullanılması yoluyla elde edilmiştir.
Phalloidin nöronal dendritler (F-aktin) boyama olgun dikenleri olmayan dikenli sinaps 2 ve olgunlaşmamış dikenler de dahil olmak üzere dendritik yapıların, çeşitli temsil eden ayrık "sıcak noktalar" ya da parlak "puncta" oluşturur. Olgunlaşmamış dikenleri ince filopodia ve yama morfolojisi bazı formları içerir ve spinogenesis 3 başlatılmasını temsil edebilir. Olgunlaşmamış dikenleri olan ve olmayan dikenli yamalar PSD95 4 yoksundur. Sadece dikenler sonraki değişiklikler değil, aynı zamanda ek dendritik yapılara F-aktin kurşun üretiminde değişiklikler, böylece synaptodendritic bütünlüğünü 5-7 araştırmak için önemli bir araç faloidin adrestir. Genel olarak, Phalloidin-pozitif (F-aktin) puncta sayısı bir aktif sinapsların arasında bir denge (eksitatör ve inhibitör), aktin dinamiklerini ve sinaps istikrar 8 yansıtmaktadır.
belirli t incelemek önemli olmasına rağmenBir tedavinin hedefi bilinmediğinde sinaps (yani, uyarıcı dikenleri) bir Dosya türleri, ilk dendritik yapıların çeşitli genel bütünlüğünü tahmin etmek için gereklidir. F-aktin önleyici sinaps bir synaptopathy gösterebilir F-aktin puncta bir değiştirilmiş sayısı dahil olmak üzere dendritik dikenler ve diğer yapıların, önemli bir bileşeni olduğu için. Bu synaptopathy daha sonra belirli değişiklikler için daha fazla araştırılması olabilir. Birden fazla sinaptik türleri / yapıların tespiti için bizim miktar yöntemi çeşitli deneysel tedaviler aşağıdaki dendritik sinaptik değişiklikler (artış ve azalışlar) genel bir tahmin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, bize bireysel nöronların dendrit belirlemenizi sağlar 35 mm cam alt yemekleri düşük yoğunlukta sıçan kortikal nöronların kültürleme açıklar. Sonra, dendritik değişiklikleri tespit etmek faloidin ve map2 boyama kullanın. Sonra, F-aktin puncta değişiklikleri ölçmek için özel yazılım kullanılır.
F-aktin puncta bireysel nöronun tüm nöronal ağ açıkça görünür olmalıdır değişiklikleri belirlemek için, bu tek bir nörondan uygun ikinci derecede…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
Referências
- Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
- Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
- Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).
- Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
- Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).
- Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
- Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).
- Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
