Количественное нитевидных актина (F-актин) Puncta на крысиной корковых нейронов
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
Нитчатых актина белок (F-актина) играет важную роль в spinogenesis, синаптической пластичности и синаптической стабильности. Изменения в дендритных F-актин богатых структур предложить изменения в синаптической целостность и связность. Здесь мы предлагаем подробный протокол для культивирования первичных крысиных корковых нейронов, фаллоидином окрашивание для F-актина Puncta и последующих методов количественного. Во-первых, фронтальная кора E18 крысиных эмбрионов диссоциируют на культуре низкой плотности клеток, затем нейроны, выращенные в пробирке в течение по крайней мере 12-14 дней. После экспериментального лечения, кортикальные нейроны окрашивали AlexaFluor 488 фаллоидином (маркировать дендритных F-актина Puncta) и ассоциированный с микротрубочками белок 2 (map2; для проверки нервных клеток и дендритных целостности). Наконец, специализированное программное обеспечение используется для анализа и количественной оценки случайно выбранных нейронов дендриты. F-актин богатых структур идентифицируются на дендритных ветвей второго порядка (диапазон длины 25-75 &# 181; м) при непрерывном map2 иммунофлюоресценции. Протокол, представленные здесь будет полезным методом для исследования изменений в дендритных синапсов структур последующих экспериментальных процедур.
Introduction
Основная цель данного исследования заключается в разработке надежного метода измерения (оценки) синаптической целостности нейронов дендритных сети. Здесь мы опишем количественный анализ F-актина Puncta в первичной крыса культивируемых нейронов, используя комбинацию фаллоидином окрашивания и иммуноцитохимическое (МУС) обнаружения дендритов с последующим анализом с использованием специализированного программного обеспечения (NIS-Elements).
Меченые phallotoxins имеют схожую аффинность к больших и малых нитей (F-актин), но не связываются с мономерной шаровое актина (Г-актина), в отличие от некоторых актина антителами 1. Неспецифическое связывание из фаллоидином незначительна, тем самым обеспечивая минимальный фон во визуализации клетки. Фаллоидином намного меньше, чем антитела, которые обычно используемых для обозначения клеточных белков для флуоресцентной микроскопии, который делает возможным более интенсивное маркировки F-актина фаллоидином. Таким образом, детальные изображения F-актина локализации в нейронах может бытьполучены при использовании меченого фаллоидином.
Фаллоидином (F-актин) окрашивание нейронов дендриты генерирует дискретные "горячие точки" или ярко "Puncta", которые представляют собой различные дендритных структур, в том числе зрелых шипов, без колючих синапсов 2 и незрелых шипами. Незрелые шипы включают тонкие филоподий и некоторые формы патч морфологии, и может представлять собой начало spinogenesis 3. Незрелые шипы и без колючих пластыри хватает PSD95 4. Изменения в производстве F-актина приводит к последующим изменениям не только в шипов, но и дополнительных дендритных структур, в результате чего фаллоидином важным инструментом для исследования synaptodendritic целостность 5-7. В общем, количество фаллоидином-положительной (F-актин) Puncta отражать баланс между активными синапсов (возбуждающих и тормозных), динамику актина и стабильности синапсов 8.
Хотя важно, чтобы изучить специфические Тypes синапсов (т.е. возбуждающие шипов), когда мишень для лечения неизвестна надо сначала оценить общую целостность различных дендритных структур. Так как F-актин является основным компонентом дендритных шипиков и других структур, в том числе тормозных синапсов, различным числом F-актина Puncta может указывать на synaptopathy. Это synaptopathy затем может быть исследован в дальнейшем для более конкретных изменений. Наш метод количественное для обнаружения нескольких синаптические типы / структуры дает общую оценку дендритных синаптических изменений (увеличений и уменьшений) следующих различных экспериментальных методов лечения.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе, мы описываем культивирования крысы корковых нейронов при низкой плотности в 35 мм с прозрачным дном посуды, которая позволяет нам идентифицировать дендритов отдельных нейронов. Далее, мы используем фаллоидином и map2 окрашивание для выявления дендритные изменения. Зат?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
Referências
- Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
- Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
- Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).
- Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
- Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).
- Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
- Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).
- Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
