वीडियो इमेजिंग और spatiotemporal मैप्स चूहे में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए
Summary
This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
Abstract
आंतों का तंत्रिका तंत्र (सत्ता) के विनियमन के जठरांत्र (सैनिक) गतिशीलता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए स्वतंत्र रूप से कार्य कर सकते हैं। सत्ता समारोह में परिवर्तन सैनिक लक्षण और रोग का एक प्रमुख कारण होते हैं और सैनिक लक्षण आत्मकेंद्रित सहित neuropsychiatric विकारों में रिपोर्ट करने के लिए योगदान कर सकते हैं। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि पृथक पेट के खंडों सहज, लयबद्ध Colonic प्रवास के लिए जाते मोटर परिसरों (CMMCs) के रूप में जाना जाता संकुचन उत्पन्न करते हैं। एक प्रक्रिया पूर्व माउस पेट के विवो तैयारियों में वर्णन किया गया है CMMCs की आंतों का तंत्रिका विनियमन का विश्लेषण करने के लिए। पेट के जानवर से विच्छेदित और करने से पहले एक अंग स्नान में cannulated जा रहा मल सामग्री को हटाने के लिए प्लावित है। डेटा एक वीडियो कैमरा अंग स्नान ऊपर तैनात माध्यम से हासिल कर लिया और एक घर में सॉफ्टवेयर पैकेज के माध्यम से उच्च संकल्प spatiotemporal नक्शे में बदल जाती है। इस तकनीक, आधारभूत सिकुड़ा पैटर्न और पेट के एस में सत्ता समारोह पर औषधीय प्रभाव का उपयोग करते हुएegments 3-4 घंटा से अधिक तुलना में किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रचार लंबाई और CMMCs की गति पेट व्यास और संकुचन आवृत्ति में परिवर्तन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दर्ज किया जा सकता है। इस तकनीक को ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में (और चूहे और गिनी पिग सहित अन्य प्रजातियों में) गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल गतिशीलता पैटर्न निस्र्पक के लिए उपयोगी है। इस तरह, CMMCs में औषधीय प्रेरित परिवर्तन जंगली प्रकार चूहों में और आत्मकेंद्रित के Neuroligin -3 R451C माउस मॉडल में दर्ज हैं। इसके अलावा, इस तकनीक को और ग्रहणी, सूखेपन और ileum सहित चूहों में विभिन्न विकासात्मक उम्र में सैनिक पथ के अन्य क्षेत्रों के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
आंतों का तंत्रिका तंत्र (सत्ता) जठरांत्र संबंधी मार्ग के आंतरिक न्यूरोनल नेटवर्क है और इस तरह की आंतों सामग्री की पाचन, पोषक तत्वों का अवशोषण और स्राव और तरल पदार्थ के रूप में विभिन्न कार्यों पुनःअवशोषण modulates। सत्ता के न्यूरॉन्स myenteric और submucosal चक्रों में स्थित हैं। Myenteric जाल जबकि सबम्यूकोसल जाल गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल गतिशीलता 1 विनियमित करने में एक प्रमुख भूमिका निभाता है मुख्य रूप से स्राव 2,3 के नियंत्रण में शामिल है। myenteric जाल जठरांत्र दीवार के अनुदैर्ध्य और परिपत्र मांसपेशी परतों के बीच स्थित है। आंतों की दीवारों की चिकनी मांसपेशियों की परतों के सिकुड़ा गतिविधि मिश्रण और आंत 3 की लंबाई के साथ आंतों सामग्री पहुंचा द्वारा जठरांत्र संबंधी मार्ग के प्राथमिक कार्यों की सुविधा। सीएनएस से जठरांत्र संबंधी मार्ग के लिए बाह्य तंत्रिका आपूर्ति विवो में जठरांत्र समारोह के लिए योगदान यद्यपि, सत्ता जठरांत्र समारोह स्वतंत्र रूप से विनियमित करने में सक्षम है। इस अनूठी विशेषता आंतों का neuronal सर्किट के कार्यात्मक जांच और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल गतिशीलता पूर्व vivo में उनके योगदान के लिए सक्षम बनाता है।
Colonic पलायन मोटर परिसरों (CMMCs) सहज, तंत्रिकाजन्य घटनाओं है कि प्रमुख मोटर पैटर्न मल छर्रों 4-9 के अभाव में पृथक माउस पेट में मनाया जाता है। CMMCs लयबद्ध संकुचन है कि (मलाशय, यानी अंधान्त्र से) एक क्षैतिज दूरी कम से कम पेट के आधे की कुल लंबाई है कि साथ में प्रचार 10 के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। CMMCs और सिकुड़ा पैटर्न है कि मल छर्रों में वृद्धि के बीच संबंध अभी तक स्पष्ट रूप से स्थापित किया जाना है, लेकिन कुछ मतभेदों के औषधीय 11 सूचित किया गया है। फिर भी, सत्ता की क्षमता सीएनएस की स्वतंत्र रूप से कार्य करने के लिए है में तंत्रिका की मध्यस्थता मोटर पैटर्न का अस्तित्वolated पेट के अंतर्निहित सत्ता में शिथिलता से उत्पन्न गतिशीलता में गड़बड़ी की जांच के लिए एक आदर्श परख प्रणाली प्रदान करता है। जठरांत्र मोटर पैटर्न की सहजता औषधीय उत्तेजनाओं के जवाब में कार्यात्मक परिवर्तन मूल्यांकन करने की अनुमति देता है।
वीडियो इमेजिंग और spatiotemporal मानचित्रण के उपयोग के पहले मात्रात्मक गिनी सूअरों 12 में छोटी आंतों peristalsis जांच करने के लिए विकसित किया गया था। इधर, एक पूर्व vivo तकनीक वर्णन किया गया है माउस colonic गतिशीलता पैटर्न के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है कि वीडियो इमेजिंग और ये रिकॉर्डिंग के विश्लेषण का उपयोग उच्च संकल्प के निर्माण के लिए (~ 100 माइक्रोन, 33 मिसे) पेट के साथ स्थिति के एक समारोह के रूप में colonic व्यास के नक्शे और समय (spatiotemporal नक्शे) के। घर में बढ़त का पता लगाने सॉफ्टवेयर (Analyse2; अनुरोध पर उपलब्ध है) का उपयोग करना, पूरी लंबाई colonic वास्तविक समय में करार क्षेत्रों से डेटा एक प्रयोग के लिए spatiotemporal नक्शे उत्पन्न करने के लिए कार्रवाई कर रहे हैं। इस चरण में, वीडियो (AVI) फ़ाइलें सुम्मा हैंrized और Analyse2 का उपयोग कर spatiotemporal नक्शे को बदल दिया। Spatiotemporal नक्शे (चित्रा 2) समय के साथ सिकुड़ना को दर्शाती है और प्रसार की गति, परिमाण, लंबाई और अवधि सहित कई मापदंडों की माप सक्षम करें। आंत व्यास भी ऊतक खंड के समग्र सिकुड़ना के एक उपाय के रूप में प्रयोग की अवधि के दौरान दर्ज की गई है। इस विधि सिकुड़ा परिसरों जो बदल आंतों का तंत्रिका कनेक्टिविटी का संकेत मिलता है की दीक्षा की बात में मतभेद की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है।
इसी तरह का एक वीडियो इमेजिंग गिनी सूअरों में गोली प्रणोदन का आकलन करने के लिए तैयार प्रोटोकॉल 13 सूचित किया गया है लेकिन यहाँ हम (यानी छर्रों के अभाव में) सहज colonic गतिशीलता की मात्रा का ठहराव के लिए वीडियो इमेजिंग दृष्टिकोण के आवेदन रूपरेखा। हम यह भी विच्छेदन और वीडियो इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए जठरांत्र ऊतक की तैयारी में सहायता के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं। इसप्रोटोकॉल आनुवंशिक माउस मॉडल सहित रोग के पशु मॉडल में जठरांत्र समारोह की आंतों का तंत्रिका नियंत्रण का विश्लेषण करने के लिए एक सुलभ और आसानी से दोहराया उपकरण के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है।
वीडियो इमेजिंग तकनीक विभिन्न औषधीय एजेंटों के जवाब में colonic गतिशीलता के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है। औषध आंत लुमेन या अंग स्नान colonic तैयारी के लिए बाहरी के माध्यम से प्रशासित किया जा सकता है। माउस जठरांत्र संबंधी मार्ग के विभिन्न क्षेत्रों में इस तरह के छोटे आंतों विभाजन और पेट में CMMCs के रूप में विशिष्ट गतिशीलता पैटर्न दिखा रहे हैं।
इस तकनीक को छोटे आंत्र समारोह में तनाव मतभेद की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; 5 हिंदुस्तान टाइम्स 3 और 5 हिंदुस्तान टाइम्स 4 गरम करने के लिए अंतर संवेदनशीलता tph2 जीन दो उपभेदों 6 में व्यक्त की बहुरूपी प्रकृति के कारण Balb / सी और C57 / BL6 चूहों के सूखेपन में मनाया गया। गतिशीलता पर 5 हिंदुस्तान टाइम्स निषेध का प्रभाव रहता है चुनावtroversial, के रूप में परस्पर विरोधी डेटा colonic क्रमाकुंचन और CMMCs 14,15 पर अंतर्जात 5 हिंदुस्तान टाइम्स के महत्व पर सूचना दी गई है। गतिशीलता पूर्व में और postnatally विकास के दौरान 7 परिवर्तन, और बीमारी 10 के पशु मॉडल में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल गतिशीलता पर जीन परिवर्तन के प्रभाव का भी वीडियो इमेजिंग के उपयोग के द्वारा जांच की जा सकती है। यहाँ हम आत्मकेंद्रित के NL3 R451C माउस मॉडल है, जो Nlgn3 जीन में एक missense उत्परिवर्तन synaptic आसंजन प्रोटीन Neuroligin -3 16 एन्कोडिंग व्यक्त colonic में गतिशीलता के एक अध्ययन के लिए विधि के प्रयोग को वर्णन। इस उत्परिवर्तन पहले ऑटिज्म स्पेक्ट्रम विकार (एएसडी) 17 है, जो दृढ़ता सैनिक शिथिलता 18-22 साथ जुड़ा हुआ है के साथ का निदान रोगियों में पहचान की थी। हम जांच की कि NL3 R451C synaptic उत्परिवर्तन सत्ता में तंत्रिका outputs वीडियो इमेजिंग तकनीक का उपयोग को प्रभावित करता है। हम आधारभूत और serotonergic 5H के जवाब में CMMCs निस्र्पक डेटा पेशटी 3/4 रिसेप्टर प्रतिपक्षी tropisetron आत्मकेंद्रित के NL3 R451C माउस मॉडल में।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस वीडियो इमेजिंग तकनीक का उपयोग करना, CMMC आवृत्ति जंगली प्रकार में colonic गतिशीलता का एक संकेत है और NL3 R451C चूहों, आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार 17 साल की एक माउस मॉडल के रूप में मापा गया था। हमारे परिण?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जेसीबी और ELH-Y रक्षा CDMRP आत्मकेंद्रित रिसर्च प्रोग्राम के अमेरिकी विभाग (AR11034) द्वारा समर्थित थे। NHMRC (1047674) मेलबोर्न विश्वास का ELH-Y.The मई स्टीवर्ट Bursary-विश्वविद्यालय के एमएस के लिए छात्रवृत्ति वित्त पोषित। हम तकनीकी योगदान के लिए अली ताहिर, फातिमा Ramalhosa और ग्रासिया Seger धन्यवाद।
Materials
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
| 4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
| 3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
Referências
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