Summary

הדמיה וידאו ומפות Spatiotemporal לנתח תנועתיות מערכת העיכול של עכברים

Published: February 03, 2016
doi:

Summary

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Abstract

מערכת העצבים enteric (ENS) ממלא תפקיד חשוב בוויסות של מערכת העיכול (GI) תנועתיות יכול לתפקד באופן עצמאי של מערכת העצבים המרכזית. שינויים בתפקוד ENS הם הגורם העיקרי של תסמינים במערכת העיכול ומחלות ועשויים לתרום סימפטומים במערכת העיכול דיווחה בהפרעות נוירופסיכיאטריות כולל אוטיזם. היא מבוססת היטב כי חלקי מעי גס מבודד ליצור התכווצויות ספונטניות, קצבית המכונה גס נודד Motor מכלולים (CMMCs). הליך לנתח את התקנה העצבית המעיים של CMMCs ב לשעבר הכנות vivo של מעי גס עכבר מתוארות. המעי הגס הוא גזור מן החיה והדיח להסיר תוכן צואתי בטרם cannulated באמבט איברים. הנתונים נרכשו באמצעות מצלמת וידאו מוצבת מעל באמבטית האיברים ועל מרת מפות spatiotemporal ברזולוציה גבוהה באמצעות חבילת תוכנה ללא צורך במיקור חוץ. באמצעות טכניקה זו, דפוסי התכווצות בסיס ואפקטים תרופתיים על תפקוד ENS במעי גס שלegments ניתן להשוות מעל 3-4 שעות. בנוסף, אורך התפשטות ומהירות CMMCs ניתן להקליט כמו גם משינויים בשיעורי קוטר הבטן ותדירות התכווצות. טכניקה זו שימושית לאפיון דפוסי תנועתיות מערכת העיכול במודלים עכבר מהונדס (וגם מינים אחרים כולל חולדות שרקן). בדרך זו, הנגרמת פרמקולוגית שינויים CMMCs נרשמים בעכברי סוג ברים במודל עכבר R451C Neuroligin-3 של אוטיזם. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מיושם על אזורים אחרים של מערכת העיכול כולל התריסריון, מְעִי צָם ואת מעי ובגילאים התפתחותיים שונים בעכברים.

Introduction

מערכת העצבים enteric (ENS) היא הרשת העצבית הפנימי של מערכת העיכול ומווסת פונקציות שונות כגון עיכול של תוכן המעי, ספיגת המזון בגוף ואת הפרשת ספיגה חוזרת של נוזלים. נוירונים של ENS ממוקמים plexuses myenteric ו submucosal. מקלעת myenteric משחק תפקיד מרכזי בוויסות תנועתיות מערכת העיכול 1 ואילו מקלעת Submucosal מטפל בעיקר בבקרה של הפרשת 2,3. מקלעת myenteric ממוקמת בין שכבות שריר אורך וחוזר של קיר העיכול. הפעילות התכווצות של שכבות שריר חלק של לדופן המעי הופך לפשוט יותר את הפונקציות העיקריות של מערכת העיכול על ידי ערבוב הדוחף תוכן המעי לאורך המעי 3. למרות ההיצע העצב החיצוני אל מערכת העיכול מן CNS תורם לתפקוד עיכול in vivo, את ENS מסוגל ויסות תפקוד מערכת העיכול באופן עצמאי. מאפיין ייחודי זה מאפשר חקירה תפקודית של מעגלים עצביים מעיים ותרומתם תנועתיות מערכת העיכול vivo לשעבר.

גס נודדים מתחמי מנוע (CMMCs) הם ספונטניים, אירועים נוירוגנית כי הם דפוס מנוע השולט שנצפה מעי גס עכבר מבודד בהעדר כדורי הצואה 4-9. CMMCs מוגדרים התכווצויות קצובות כי להפיץ לאורך המרחק האופקי הוא לפחות מחצית האורך הכולל של המעי הגס (כלומר, מן cecum אל פי הטבעת) 10. הקשר בין CMMCs ואת דפוסי ההתכווצות שמניעי כדורי צואה הוא עדיין לא נקבע בבירור, עם זאת כמה הבדלים תרופתיים דווחו 11. עם זאת, היכולת של ENS לתפקד באופן עצמאי של מערכת עצבים מרכזיים ואת קיומם של דפוסי מנוע בתיווך עצבי כלומרהמעי הגס olated מספק מערכת assay אידיאלי לבחון הפרעות תנועתיות כתוצאה מחוסר תפקוד ENS הבסיסית. הספונטניות של דפוסי מנוע עיכול מאפשרת שינויים תפקודיים בתגובה לגירויים תרופתית להיבדק.

השימוש הדמיה וידאו ומיפוי spatiotemporal פותחה לראשונה לבחון הפריסטלטיקה של המעי הדק כמותית שרקנים 12. הנה, טכניקת vivo לשעבר מתוארת המאפשרת חקר דפוסי תנועתיות עכבר גסים באמצעות הדמיה וידאו וניתוח של הקלטות אלה לבנות ברזולוציה גבוהה (~ 100 מיקרומטר, 33 msec) מפות של בקוטר גס כפונקציה של מיקום לאורך המעי הגס ושל זמן (מפות spatiotemporal). שימוש ללא צורך במיקור חוץ בתוכנת איתור קצה (Analyse2; על פי דרישה), נתונים מתחומי הגס באורך מלא קבלנות בזמן אמת מעובדים ליצור מפות spatiotemporal עבור כל ניסוי. בשלב זה, וידאו (AVI) הקבצים הם ייתרוrized ועל המרה מפות spatiotemporal באמצעות Analyse2. מפות Spatiotemporal (איור 2) מתארים התכווצות לאורך זמן ולאפשר מדידת פרמטרים מרובים כולל מהירות התפשטות, גודל, אורך ומשך. קוטר גוט נרשם גם לאורך כל תקופת הניסוי כאמצעי של ההתכווצות הכוללת של מגזר הרקמות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת לזהות הבדלי נקודת חניכה של מתחמי התכווצות מה שיכול להעיד קישוריות עצבית מעיים שונה.

פרוטוקול הדמיה וידאו דומה שנועד להעריך הנעה גלולה ב שרקנים דווחה 13 אולם כאן נתאר את יישום הגישה הדמיה וידאו כימות של תנועתיות המעי הגס ספונטנית (כלומר, בהעדר כדורי). כמו כן אנו מספקים מידע מפורט כדי לסייע לנתיחה והכנת רקמות gastrointestinal עבור הגישה הדמיה וידאו. זֶהפרוטוקול מספק לחוקרים עם כלי נגיש לשכפל בקלות לניתוח שליטה עצבית מעיים של פונקצית עיכול במודלים של בעלי חיים של מחלה כולל מודלי עכבר גנטי.

טכניקת דימות וידאו מאפשרת ניתוח של תנועתיות המעי הגס בתגובה סוכני תרופתי שונים. סמים יכולים להיות מנוהלים באמצעות לומן המעי או באמבטית האיברים החיצוני להכנה הגסה. באזורים שונים של מערכת העיכול העכבר מפגינים דפוסי תנועתיות ספציפיות כגון פילוח של המעי הדק CMMCs במעי הגס.

טכניקה זו נעשתה שימוש כדי לזהות הבדלי זן בתפקוד המעי דק; רגישות ההפרש ל 5-HT 3 ו 5-HT 4 אנטגוניסטים נצפו מְעִי צָם של Balb / c ועכברים C57 / BL6 בשל אופי צורות של הגן tph2 מתבטא 6 שני זנים. השפעת עיכוב 5-HT על תנועתיות נשאר conשנוי במחלוקת, כפי דווחו נתונים סותרים על החשיבות של 5-HT אנדוגני על הפריסטלטיקה במעי גס, CMMCs 14,15. שינויים טרום תנועתיות לאחר הלידה במהלך הפיתוח 7, ואת ההשפעות של מוטציות גנטיות על תנועתיות הקיבה והמעיים במודלים של בעלי חיים של מחלת 10 יכול גם להיבדק על ידי ניצול הדמיה וידאו. כאן אנו מדגימים שימוש בשיטת לצורכי מחקר על תנועתיות המעי הגס במודל של אוטיזם העכבר R451C NL3, המבטאת מוטציה missense בגן Nlgn3 המקודד את החלבון הידבקות הסינפטי Neuroligin-3 16. המוטציה זו זוהתה לראשונה בחולים שאובחנו עם הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD) 17, אשר מזוהה מאוד עם תפקוד לקוי GI 18-22. חקרנו אם סינפטיים מוטצית R451C NL3 משפיעה פלט עצבי ENS באמצעות טכניקת דימות וידאו. אנו מציגים נתונים מאפיינים CMMCs בתחילת מחקר בתגובת 5H serotonergicT 3/4 קולטן אנטגוניסט tropisetron במודל של אוטיזם העכבר R451C NL3.

Protocol

טיפול בבעלי חיים נקע בצוואר הרחם של חיות לפני כל הניסויים בוצעו אך ורק על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת מלבורן (אתיקה ID: 1,212,494.7) רקמות 1. איסוף Dissection <li style=";text-align:right;directi…

Representative Results

עד 90% מהחולים עם ASD לחוות מערך של הפרעות במערכת העיכול, כולל שלשול ועצירות 18,24,25. עם זאת, הגורמים הבסיסיים של בעיות במערכת עיכול אלה אינם ידועים. מוטציות רבות זיהו בחולים עם ASD משויכים תורמים חלבונים סינפטיים לשינויים והפרעות בשידור סינפטי או…

Discussion

באמצעות טכניקה הדמיה בסרטון הזה, תדירות CMMC נמדדה כאינדיקציה תנועתיות במעי הגס בקרב סוג בר עכברים R451C NL3, במודל של עכברים של הפרעת ספקטרום האוטיזם 17. התוצאות שלנו מצביעים על ירידה במספר CMMCs בעכברים מוטציה NL3 R451C בהשוואה לעכברים סוג בר בנוכחות של אנטגונ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JCB ו ELH-Y נתמכו תוכנית משרד ההגנה האמריקאי CDMRP אוטיזם מחקר (AR11034). NHMRC (1047674) כדי ELH-Y.The במאי סטיוארט הגזברות-אוניברסיטת אמון מלבורן במימון מלגה MS. אנו מודים עלי טאהר, פטימה Ramalhosa ו גרציה סיגר לתרומות טכנית.

Materials

Reagents
NaCl (MW: 58.44) Sigma-Aldrich S7653-250G
KCl (MW: 74.55) Sigma-Aldrich P9333-500G
NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) Chem Supply 471-500G
MgSO4.7H20 (MW: 246.48) Chem Supply MA048
CaCl2.2H2O (MW: 147.02) Chem Supply CA033
D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) Chem Supply GA018-500G
NaHCO3 (MW: 84.01) Chem Supply GA018-500G
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Two chambered organ bath
Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm
Custom Made Contact Laboratory Directly 
 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR Dow Corning Australia Pty Ltd 1890573
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT  Dow Corning Australia Pty Ltd 1064291
STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S Terumo Medical Corporation 0912-2006
SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL Terumo Medical Corporation N/A
1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing Masterflex 508-008
1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing Masterflex 508-005
1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing Masterflex 508-007
1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing  Masterflex 96410 – 14
4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing  Masterflex 96410 – 15 
3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing  Masterflex 96410 -16
Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml      Thermofisher Scientific  100-400
CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm 
CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm
Water heater  (thermo regulator)  Ratek  TH7000 
Logitech Webcam Logitech
Name Company Catalog Number Comments
Software
Virtual Dub – 1.9 11 virtualdub.org
MATLAB R2012a  Graph Pad
Logitech Webcam Software Logitech

Referências

  1. Powell, A. K., O’Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
  2. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
  3. Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
  4. Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
  5. Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
  6. Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
  7. Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
  8. Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
  9. Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
  10. Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung’s disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
  11. Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
  12. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  13. Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
  14. Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
  15. Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
  16. Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
  17. Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
  18. Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
  19. Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
  20. Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
  21. McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
  22. Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
  23. Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
  24. Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
  25. Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, S1-S18 (2010).
  26. Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
  27. Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
  28. Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
  29. Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung’s disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
  30. Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung’s disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
  31. Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
  32. Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene?. Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
  33. Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
  34. Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
  35. Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
  36. Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
  37. Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
check_url/pt/53828?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Swaminathan, M., Hill-Yardin, E., Ellis, M., Zygorodimos, M., Johnston, L. A., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice. J. Vis. Exp. (108), e53828, doi:10.3791/53828 (2016).

View Video