Video Imaging en Maps Spatiotemporal om gastro-intestinale motiliteit analyseren in Muizen
Summary
This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
Abstract
Het enterische zenuwstelsel (ENS) speelt een belangrijke rol bij het reguleren van gastro-intestinale (GI) motiliteit en onafhankelijk van het centrale zenuwstelsel werken. Veranderingen in ENS functie zijn een belangrijke oorzaak van GI symptomen en ziekten en kunnen bijdragen aan GI afwijkingen die bij neuropsychiatrische aandoeningen waaronder autisme. Het staat vast dat geïsoleerde colon segmenten genereren spontaan, ritmische samentrekkingen bekend als de dikke darm migreren Motor Complexen (CMMCs). Een procedure om de enterische neurale regulering van CMMCs in ex vivo de voorbereidingen van de muis colon wordt beschreven te analyseren. De dikke darm is losgesneden van het dier en gespoeld fecale inhoud voorafgaand aan de canule in een orgaanbad verwijderen. De gegevens worden verkregen via een videocamera boven het orgaanbad geplaatst en omgezet in hoge resolutie spatiotemporele kaarten via een in-house software. Met deze techniek basislijn contractiele patronen en farmacologische effecten ENS functie colon segments vergelijkbaar gedurende 3-4 uur. Bovendien kunnen voortplantinglengte en snelheid van CMMCs ook worden die als veranderingen in de darm diameter en contractiefrequentie. Deze techniek is nuttig voor het karakteriseren maagdarmmotiliteit patronen in transgene muismodellen (en andere soorten, waaronder ratten en cavia). Zo zijn farmacologisch geïnduceerde veranderingen in CMMCs opgenomen in wild type muizen en in de neuroligin-3 R451C muismodel van autisme. Daarnaast kan deze techniek worden toegepast op andere gebieden van het maagdarmkanaal waaronder het duodenum, jejunum en ileum en in verschillende ontwikkelingsstadia leeftijden in muizen.
Introduction
Het enterische zenuwstelsel (ENS) is de intrinsieke neuronale netwerk van het maagdarmkanaal en moduleert diverse functies zoals vertering van darminhoud, opname van voedingsstoffen en de secretie en reabsorptie van vocht. Neuronen van de ENS bevinden zich in de myenterische en submucosale plexus. De myenterische plexus speelt een belangrijke rol bij het reguleren van gastro-intestinale motiliteit 1 dat de submucosale plexus zich voornamelijk bezig met de controle secretie 2,3. De myenterische plexus ligt tussen de longitudinale en circulaire spierlagen van de darmwandcomponenten. De contractiele activiteit van de gladde spierlagen van de darmwand vergemakkelijkt de primaire functies van het maagdarmkanaal door mengen en darminhoud voortbewegen over de lengte van de darm 3. Hoewel de extrinsieke innervatie naar het maagdarmkanaal van de CNS bijdraagt aan gastro-intestinale functie in vivoDe ENS kan reguleren gastro-intestinale functie onafhankelijk. Deze unieke eigenschap maakt het functionele onderzoek van enterische neuronale circuits en hun bijdrage aan maagdarmmotiliteit ex vivo.
Colon migreren motor complexen (CMMCs) zijn spontane, neurogene gebeurtenissen die zijn de belangrijkste motor patroon waargenomen in geïsoleerde muis colon in de afwezigheid van fecale pellets 4-9. CMMCs worden gedefinieerd als ritmische samentrekkingen die zich voortplanten langs een horizontale afstand die ten minste de helft van de totale lengte van het colon (dwz van de blindedarm naar de endeldarm) 10. De relatie tussen CMMCs en de contractiele patronen die fecale pellets voortbewegen moet nog duidelijk worden aangetoond, maar sommige farmacologische verschillen zijn gemeld 11. Desondanks moet het vermogen van de ENS onafhankelijk functioneren van het CZS en het bestaan van neurale gemedieerde motorische patronen in de IMolated colon biedt een ideale test systeem om verstoringen in de beweeglijkheid als gevolg van onderliggende ENS dysfunctie te onderzoeken. De spontaniteit van gastrointestinale motorische patronen maakt de functionele veranderingen in reactie op farmacologische stimuli worden beoordeeld.
Het gebruik van video-imaging en spatiotemporele mapping werd voor het eerst ontwikkeld om kwantitatief te onderzoeken dunne darm peristaltiek in cavia's 12. Hier wordt een ex vivo werkwijze beschreven dat de studie van muis motiliteitspatronen maakt gebruik van videobeelden en analyse van deze opnames met hoge resolutie weer (~ 100 urn, 33 msec) kaarten van dikke diameter als functie van positie langs de colon en tijd (tijdruimtelijk maps). Met behulp van in-house edge detectie software (Analyse2; beschikbaar op aanvraag), de gegevens van de volledige lengte colon segmenten aanbestedende in real-time worden verwerkt tot spatiotemporele kaarten voor elk experiment te genereren. In deze stap, video (AVI) bestanden zijn summarized en omgezet in spatiotemporele kaarten met behulp van Analyse2. Tijdruimtelijk kaarten (figuur 2) tonen contractiliteit tijd en maken de meting van meerdere parameters zoals voortplantingssnelheid, omvang, lengte en duur. Gut diameter ook geregistreerd gedurende de duur van het experiment als een maat voor de globale contractiliteit van het weefselsegment. Deze methode kan worden toegepast om verschillen in de plaats van opening van contractiele complexen die veranderde enterische neurale verbindingen kunnen duiden.
Eenzelfde videobeelden model zodat pellet aandrijving beoordelen cavia's is gerapporteerd 13 maar hier beschrijven we de toepassing van de videobeelden benadering voor het kwantificeren van spontane motiliteit (dat wil zeggen in afwezigheid van pellets). Wij ook informatie om te helpen bij de dissectie en voorbereiding van maag-darmweefsel voor videobeelden benadering. Dezeprotocol voorziet onderzoekers een toegankelijke en eenvoudig herhaald voor de analyse van enterische neuronale controle van gastrointestinale functie in diermodellen van ziekten met inbegrip van genetische muismodellen.
De videobeelden techniek maakt de analyse van motiliteit in reactie op verschillende farmacologische middelen. Medicijnen kunnen worden toegediend via het darmlumen of orgaanbad buiten de colon preparaat. Verschillende gebieden van de muis maagdarmkanaal vertonen specifieke motiliteitspatronen zoals kleine darm segmentatie en CMMCs in de dikke darm.
Deze techniek is gebruikt om stamverschillen in kleine darmfunctie identificeren; differentiële gevoeligheid voor 5-HT3 pt 5-HT4-antagonisten werden waargenomen in het jejunum van Balb / c en C57 / Bl6 muizen als gevolg van de polymorfe aard van de TPH2 gen expressie in de twee stammen 6. Het effect van 5-HT-remming op beweeglijkheid blijft concontroversiële, zoals tegenstrijdige gegevens gerapporteerd over het belang van endogene 5-HT op colon peristaltiek en CMMCs 14,15. Veranderingen in motiliteit pre- en postnataal 7 tijdens de ontwikkeling en de effecten van genmutaties op gastro-intestinale motiliteit in diermodellen van de ziekte kan 10 worden onderzocht door gebruik videobeelden. Hier tonen we gebruik van de werkwijze voor de studie van motiliteit in het NL3 R451C muismodel van autisme, dat een missense mutatie in het gen dat voor het Nlgn3 synaptische adhesieproteïne neuroligin 3-16 tot expressie brengt. Deze mutatie werd het eerst geïdentificeerd in patiënten met autisme spectrum stoornis (ASS) 17, die sterk wordt geassocieerd met GI dysfunctie 18-22. We hebben onderzocht of de NL3 R451C synaptische mutatie invloed neurale uitgangen in de ENS met behulp van de video-beeldvormende techniek. We presenteren kenmerkende gegevens CMMCs op baseline en in reactie op het serotonerge 5HT 3/4 receptorantagonist tropisetron in het NL3 R451C muismodel van autisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van deze video beeldvormende techniek, werd CMMC frequentie gemeten als een indicatie van motiliteit in wild type en NL3 R451C muizen, een muismodel van autisme spectrum stoornis 17. Onze resultaten duiden op een vermindering van het aantal CMMCs in mutante NL3 R451C muizen in vergelijking met wildtype muizen in aanwezigheid van de 5HT 3/4 receptorantagonist Tropisetron suggereert dat NL3 R451C muizen een verhoogde gevoeligheid vertonen voor Tropisetron. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCB en ELH-Y werden gesteund door het Amerikaanse ministerie van Defensie CDMRP Autism Research Program (AR11034). NHMRC (1047674) om ELH-Y.The May Stewart Beurs-University of Melbourne vertrouwen gefinancierde beurs voor MS. Wij danken Ali Taher, Fátima Ramalhosa en Gracia Seger voor technische bijdragen.
Materials
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
| 4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
| 3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
Referências
- Powell, A. K., O’Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung’s disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung’s disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung’s disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene?. Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
