Imágenes de vídeo y mapas espacio-temporales para Analizar la motilidad gastrointestinal en ratones
Summary
This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
Abstract
El sistema nervioso entérico (ENS) juega un papel importante en la regulación de la motilidad gastrointestinal (GI) y puede funcionar independientemente del sistema nervioso central. Cambios en la función ENS son una causa importante de los síntomas GI y la enfermedad y pueden contribuir a los síntomas GI reportados en los trastornos neuropsiquiátricos, incluyendo el autismo. Está bien establecido que los segmentos de colon aisladas generan contracciones rítmicas espontáneas, conocidas como colónica Migración Motor Complejos (CMMCs). Un procedimiento para analizar la regulación neural entérica de CMMCs pt la ex vivo de las preparaciones de colon de ratón se describe. El colon se disecciona del animal y lava para eliminar el contenido fecal antes de ser canulado en un baño de órganos. Los datos se adquieren a través de una cámara de vídeo situada por encima del baño de órganos y se convierte en mapas espacio-temporales de alta resolución a través de un paquete de software de la casa. Usando esta técnica, los patrones contráctiles de línea de base y los efectos farmacológicos sobre la función ENS en Colon segments se pueden comparar más de 3-4 horas. Además, la longitud de propagación y la velocidad de CMMCs se pueden grabar, así como cambios en el diámetro del intestino y frecuencia de las contracciones. Esta técnica es útil para la caracterización de los patrones de la motilidad gastrointestinal en modelos de ratones transgénicos (y en otras especies, incluyendo rata y cobaya). De esta manera, los cambios farmacológicamente inducidos en CMMCs se registran en ratones de tipo salvaje y en el modelo de ratón R451C neuroligin-3 del autismo. Además, esta técnica se puede aplicar a otras regiones del tracto GI, incluyendo el duodeno, el yeyuno y el íleon y a diferentes edades de desarrollo en ratones.
Introduction
El sistema nervioso entérico (ENS) es la red neuronal intrínseca del tracto gastrointestinal y modula diversas funciones tales como la digestión del contenido intestinal, la absorción de nutrientes y la secreción y reabsorción del líquido. Las neuronas de la ENS están situados en los plexos mientérico y submucoso. El plexo mientérico juega un papel importante en la regulación de la motilidad gastrointestinal 1, mientras que el plexo submucoso es principalmente involucrado en el control de la secreción de 2,3. El plexo mientérico está situado entre las capas musculares longitudinales y circulares de la pared gastrointestinal. La actividad contráctil de las capas musculares lisas de la pared intestinal facilita las funciones primarias del tracto gastrointestinal mediante la mezcla y propulsando contenido intestinal a lo largo de la longitud del intestino 3. Aunque la inervación extrínseca al tracto gastrointestinal del CNS contribuye a la función gastrointestinal in vivo, El ENS es capaz de regular la función gastrointestinal de forma independiente. Esta característica única permite a la investigación funcional de los circuitos neuronales entéricas y su contribución a la motilidad gastrointestinal ex vivo.
Colon migran complejos de motor (CMMCs) son eventos espontáneos, neurogénicos que son el patrón motor predominante observada en aislados de colon de ratón en ausencia de bolitas fecales 4-9. CMMCs se definen como contracciones rítmicas que se propagan a lo largo de una distancia horizontal que es al menos la mitad de la longitud total de los dos puntos (es decir, desde el ciego hasta el recto) 10. La relación entre CMMCs y los patrones contráctiles que impulsan bolitas fecales aún no se ha establecido claramente, sin embargo, algunas diferencias farmacológicas se han reportado 11. Sin embargo, la capacidad de la ENS de funcionar independientemente de la CNS y la existencia de patrones motores neural mediada en la SIde colon olated proporciona un sistema de ensayo ideal para examinar las perturbaciones en la motilidad resultantes de la disfunción ENS subyacente. La espontaneidad de los patrones motores gastrointestinales permite cambios funcionales en respuesta a estímulos farmacológicos que han de evaluarse.
El uso de imágenes de vídeo y mapeo espacio-temporal se desarrolló primero en examinar cuantitativamente pequeña peristaltismo intestinal en cerdos de guinea 12. Aquí, una técnica ex vivo se describe que permite el estudio de los patrones de la motilidad del colon de ratón utilizando imágenes y el análisis de estas grabaciones de video para la construcción de alta resolución (~ 100 micras, 33 mseg) mapas de diámetro del colon como una función de posición a lo largo del colon y de tiempo (mapas espacio-temporales). El uso de software interno de detección de bordes (Analyse2; a petición), los datos de larga duración en segmentos colónicos contratantes en tiempo real son procesados para generar mapas espacio-temporales para cada experimento. En este paso, los archivos de vídeo (AVI) son summatorizado y convertido en espacio-temporales mapas utilizando Analyse2. Mapas espacio-temporales (Figura 2) representan la contractilidad en el tiempo y permiten la medición de varios parámetros tales como la velocidad de propagación, la magnitud, la duración y la duración. diámetro Gut también se registra a lo largo de la duración del experimento como una medida de la contractilidad global del segmento de tejido. Este método se puede aplicar para identificar diferencias en el punto de inicio de complejos contráctiles lo que podría indicar la conectividad neuronal entérico alterado.
Un protocolo de formación de imágenes de vídeo similar diseñado para evaluar la propulsión pellet en cobayas Se ha informado que 13 sin embargo aquí describimos la aplicación del enfoque de formación de imágenes de vídeo para la cuantificación de la motilidad colónica espontánea (es decir, en ausencia de gránulos). También proporcionamos información detallada para ayudar en la disección y preparación del tejido gastrointestinal para el enfoque de formación de imágenes de vídeo. Estaprotocolo proporciona a los investigadores una herramienta accesible y fácilmente replicado para el análisis de control neural entérico de la función gastrointestinal en modelos animales de enfermedad, incluyendo modelos genéticos de ratón.
La técnica de imagen de vídeo permite el análisis de la motilidad del colon en respuesta a diversos agentes farmacológicos. Los medicamentos pueden ser administrados a través de la luz del intestino o el baño de órganos externos a la preparación del colon. Diferentes regiones del tracto gastrointestinal de ratón exhiben patrones de motilidad específicos, tales como pequeño segmentación intestinal y CMMCs en el colon.
Esta técnica se ha utilizado para identificar las diferencias de deformación en función del intestino delgado; sensibilidad diferencial a 5-HT 3 y 5-HT 4 antagonistas se observaron en el yeyuno de ratones Balb / c y ratones C57 / Bl6 debido a la naturaleza polimórfica del gen TPH2 expresado en las dos cepas 6. El efecto de la inhibición de 5-HT en la motilidad se mantiene conpolémico, ya que los datos contradictorios se ha informado sobre la importancia de la 5-HT endógena en el peristaltismo del colon y CMMCs 14,15. Las alteraciones en la motilidad pre- y postnatal durante el desarrollo 7, y los efectos de las mutaciones del gen sobre la motilidad gastrointestinal en modelos animales de la enfermedad 10 también pueden ser examinados mediante la utilización de imágenes de vídeo. Aquí se ilustra el uso del método para un estudio de la motilidad del colon en el modelo de ratón NL3 R451C de autismo, que expresa una mutación sin sentido en el gen que codifica la proteína NLGN3 adhesión sináptica neuroligin-3 16. Esta mutación se identificó por primera vez en pacientes con diagnóstico de trastorno del espectro autista (TEA) 17, que está fuertemente asociada con la disfunción GI 18-22. Hemos investigado si la mutación R451C sináptica NL3 afecta a las salidas de los nervios en la ENS utilizando la técnica de imagen de vídeo. Se presentan los datos que caracterizan CMMCs al inicio y en respuesta a la 5H serotoninérgicaT 3/4 antagonista del receptor de tropisetrón en el modelo de ratón NL3 R451C del autismo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando esta técnica de formación de imágenes de vídeo, la frecuencia CMMC se midió como una indicación de la motilidad del colon en ratones de tipo salvaje y NL3 R451C, un modelo de ratón de trastorno del espectro autista 17. Nuestros resultados indican una reducción en el número de CMMCs en ratones NL3 R451C mutantes en comparación con ratones de tipo salvaje en presencia del antagonista del receptor 5HT 3/4 Tropisetron lo que sugiere que los ratones NL3 R451C<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCB y ELH-Y fueron apoyados por el Departamento de Programa de Investigación del Autismo CDMRP Defensa (AR11034). NHMRC (1047674) a ELH-Y.The mayo Stewart beca-Universidad de Melbourne confianza financiado becas para la EM. Agradecemos a Ali Taher, Fátima Ramalhosa y Gracia Seger para las contribuciones técnicas.
Materials
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
| 4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
| 3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
Referências
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