マウスにおける胃腸の運動を分析するためにビデオ画像と時空間マップ
Summary
This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
Abstract
腸管神経系（ENS）は、胃腸（GI）運動性の調節に重要な役割を果たしており、独立して、中枢神経系の機能することができます。 ENS機能の変化は、GI症状や病気の主な原因であると自閉症などの精神神経疾患で報告されたGI症状に寄与することができます。よく分離された大腸セグメントは結腸移行モーター複合体（CMMCs）として知られている自発的な、リズミカルな収縮を発生させることが確立されています。マウス大腸のex vivoでの製剤でCMMCsの腸内神経調節を分析するための手順が記載されています。コロンは、動物から切除し、前の器官槽にカニューレを挿入されることに糞便コンテンツを削除するためにフラッシュされます。データは、器官浴の上方に位置し、ビデオカメラを介して取得し、社内ソフトウェアパッケージを介して、高解像度時空間マップに変換されます。この技術では、ベースライン収縮パターンと大腸の内ENS機能の薬理効果を使用しましたegmentsは3-4時間かけて比較することができます。また、CMMCsの伝搬長さと速度は、腸の直径と収縮頻度の変化と同様に記録することができます。この技術は、トランスジェニックマウスモデルにおいて（およびラットとモルモットを含む他の種で）消化管運動パターンを特徴付けるために有用です。このように、CMMCsで薬理学的に誘導された変化は、野生型マウスおよび自閉症のニューロリギン-3 R451Cマウスモデルに記録されています。さらに、この技術は、十二指腸、空腸および回腸を含むマウスにおける異なる発育年齢でGI管の他の領域にも適用することができます。
Introduction
腸神経系（ENS）は、胃腸管の本質的な神経回路網であり、そのような腸の内容物の消化、栄養素の吸収および分泌および流体の再吸収など様々な機能を調節します。 ENSのニューロンは、腸管筋及び粘膜下神経叢に位置しています。筋層間神経叢は粘膜下神経叢が分泌2,3の制御に主に関与しているのに対し、消化管運動1の調節に重要な役割を果たしています。筋層間神経叢は、胃腸壁の長手方向および円形筋肉層との間に位置しています。腸壁の平滑筋層の収縮活性は、腸3の長さ方向に沿って腸内容物を混合し、推進することにより、消化管の主な機能を容易にします。 CNSから消化管への外因性の神経供給は 、インビボで胃腸機能に寄与しているが、ENSは、独立して、消化管機能を調節することが可能です。このユニークな特徴は、機能性腸内神経回路の調査および ex vivo消化管運動への貢献を可能にします。
結腸移行モーター複合体（CMMCs）糞粒4-9の不在下で単離したマウス結腸において観察された支配的な運動パターンであり、自発的、神経性のイベントです。 CMMCsは、コロン（ すなわち、盲腸から直腸まで）10の少なくとも半分の合計の長さである水平距離に沿って伝播リズミカルな収縮として定義されています。糞便ペレットを推進CMMCsと収縮パターンとの関係は明らかにいくつかの薬理学的な違いが11報告されており、確立されてまだあります。それにもかかわらず、CNSの独立して機能するENSの能力とISの神経媒介運動パターンの存在olatedコロンは、基礎となるENS機能不全に起因する運動性の障害を調べるのに理想的なアッセイ系を提供します。胃腸の運動パターンの自発性は、薬理学的刺激に応答して、機能の変更を評価することができます。
ビデオ画像と時空間のマッピングを使用すると、最初の定量的モルモット12に小腸の蠕動運動を調べるために開発されました。ここでは、 エクスビボ技術は、高解像度を構築するためにビデオ画像及びこれらの記録の分析を用いて、マウス結腸運動パターンの研究を可能にすることが記載されている（〜100ミクロン、33ミリ秒）大腸に沿った位置の関数として、結腸の直径のマップ時間の（時空間マップ）。社内のエッジ検出ソフトウェアの使用（Analyse2、リクエストに応じて利用可能）を、リアルタイムで収縮し、全長結腸セグメントからのデータは、各実験のための時空間マップを生成するために処理されます。このステップでは、動画（AVI）ファイルはスンマですrizedとAnalyse2を使用して時空間マップに変換します。時空間マップ（ 図2）は、時間をかけて収縮性を表しており、伝搬速度、大きさ、長さ及び持続時間を含む複数のパラメータの測定を可能にします。腸の直径はまた、組織セグメントの全体的な収縮の尺度として実験期間を通じて記録されています。この方法は、改変された腸内神経の接続性を示している可能性が収縮複合体の開始点の違いを識別するために適用することができます。
モルモットにおいてペレット推進力を評価するために設計された同様の映像イメージングプロトコルは、しかしここでは、（ペレットの不存在下で、すなわち ）自発結腸運動の定量化のためのビデオ画像アプローチの適用を概説13に報告されています。我々はまた、ビデオ画像のアプローチのための切開および胃腸組織の調製を補助するための詳細な情報を提供します。このプロトコルは、遺伝的マウスモデルを含む、疾患の動物モデルにおいて胃腸機能の腸内神経制御を分析するためのアクセス可能な、簡単に複製されたツールを使って研究者に提供します。
ビデオイメージング技術は、様々な薬理学的因子に応答して、結腸運動の解析を可能にします。薬物は、腸内腔または結腸の準備の外部器官浴を介して投与することができます。マウス胃腸管の異なる領域は、結腸における小腸区分およびCMMCsような特定の運動パターンを示します。
この技術は、小腸機能の歪みの違いを識別するために使用されています。 5-HT 3および5-HT 4アンタゴニストの差動感度は、2つの系統6で発現TPH2遺伝子の多型性のためのBalb / cおよびC57 / BL6マウスの空腸で観察されました。運動性の5-HT阻害の効果は、詐欺のままtroversial、相反するデータが結腸の蠕動とCMMCs 14,15上の内因性5-HTの重要性について報告されています。運動前および出生後発達7中の変化、および疾患10の動物モデルにおいて胃腸運動の遺伝子変異の効果は、ビデオ画像を利用して調べることができます。ここでは、シナプス接着タンパク質のニューロリギン-3 16をコードする Nlgn3遺伝子におけるミスセンス変異を表現する自閉症のNL3 R451Cマウスモデルにおける結腸運動の研究のための方法の使用を例示します。この変異は、最初に強くGI機能障害18-22に関連している自閉症スペクトラム障害（ASD）17、と診断された患者で同定されました。私たちは、NL3 R451Cシナプス変異がビデオイメージング技術を用いて、ENSにおける神経出力に影響を与えるかどうかを調べました。私たちは、ベースライン時およびセロトニン5Hに応じてCMMCsを特徴付けるデータを提示T 3/4受容体アンタゴニストトロピセトロン 自閉症のNL3 R451Cマウスモデルインチ
Protocol
Representative Results
Discussion
Using this video imaging technique, CMMC frequency was measured as an indication of colonic motility in wild type and NL3R451C mice, a mouse model of autism spectrum disorder17. Our results indicate a reduction in the number of CMMCs in mutant NL3R451C mice compared to wild type mice in the presence of the 5HT3/4 receptor antagonist Tropisetron suggesting that NL3R451C mice exhibit an increased sensitivity to Tropisetron. Accordingly, we propose that the neuroligin-3…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCB and ELH-Y were supported by the US Department of Defense CDMRP Autism Research Program (AR11034). NHMRC (1047674) to ELH-Y.The May Stewart Bursary-University of Melbourne trust funded scholarship to MS. We thank Ali Taher, Fátima Ramalhosa and Gracia Seger for technical contributions.
Materials
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
| 4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
| 3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
Referências
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