من خلال المرآة: المجهري الوقت الفاصل بين وتتبع طولية من الخلايا واحدة لدراسة العلاج المضادة للسرطان
Summary
Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Abstract
استجابة الخلايا وحيدة إلى الأدوية المضادة للسرطان تساهم بشكل كبير في تحديد استجابة السكان، وبالتالي تعتبر عاملا رئيسيا يسهم في النتيجة الإجمالية. Immunoblotting، التدفق الخلوي والتجارب خلية ثابتة وغالبا ما تستخدم لدراسة كيفية استجابة الخلايا للأدوية المضادة للسرطان. وهذه الأساليب هي مهمة، ولكن لديهم العديد من أوجه القصور. التباين في ردود المخدرات بين السرطان والخلايا الطبيعية، وبين خلايا المنشأ السرطانية المختلفة، وعابرة وردود نادرة من الصعب أن نفهم باستخدام فحوصات المتوسط السكان ودون أن تكون قادرة على تتبع مباشرة وتحليلها بشكل طولي. المجهر بشكل خاص مناسبة تماما لصورة الخلايا الحية. التطورات في مجال التكنولوجيا تمكننا من روتيني خلايا الصورة في القرار الذي تمكن ليس فقط تتبع الخلية، ولكن أيضا مراقبة مجموعة متنوعة من الاستجابات الخلوية. وصفنا هذا النهج في التفاصيل التي تسمح للتصوير المستمر الوقت الفاصل بينالخلايا خلال الاستجابة للدواء لفي الأساس طالما رغبت في ذلك، عادة ما يصل إلى 96 ساعة. استخدام الاختلافات في النهج، وخلايا يمكن رصدها لأسابيع. مع توظيف المشفرة وراثيا أجهزة الاستشعار الفلورسنت العديد من العمليات، ومسارات والاستجابات يمكن اتباعها. وتبين لنا الأمثلة التي تشمل تتبع النوعي والكمي لنمو الخلايا وتقدم دورة الخلية، وديناميات كروموسوم، الحمض النووي من التلف، وموت الخلايا. نحن أيضا مناقشة الاختلافات في الأسلوب ومرونته، وتسليط الضوء على بعض المخاطر المشتركة.
Introduction
المجهر الخلية الحية وتتبع طولية من الخلايا واحدة ليست تقنية جديدة. من أقرب المجاهر، وقد لاحظ المتحمسين والعلماء ودرس الخلايا وحيدة والكائنات، تصرفاتهم، والتنمية 1-3. ومن الأمثلة الشهيرة من أواخر ديفيد روجرز في جامعة فاندربيلت في 1950s يظهر العدلات الإنسان في بقعة من الدم مطاردة بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية، وفي نهاية المطاف عملية البلعمة (4). هذا الفيلم الخلية الحية هو مثال ممتاز لكيفية عمليات متعددة يمكن ملاحظتها والمترابطة في تجربة واحدة: الاستشعار من التدرج الكيميائية، والميكانيكا وسرعة الحركة خلية، خلية الأشكال ديناميكية، التصاق، والبلعمة من العوامل المسببة للأمراض.
وقد أدى ظهور المجاهر مؤتمتة بالكامل والكاميرات الرقمية حساسة للغاية في أعداد متزايدة من المحققين باستخدام المجهر لطرح الأسئلة الأساسية في بيولوجيا الخلية تتراوح ومدمج كيف تتحرك خلايا 5،6 و 7،8 تنقسم إلى العضيم ديناميات والاتجار غشاء 9-11. غير الفلورسنت، المجهري brightfield، بما في ذلك على النقيض من المرحلة (PC)، الذي حصل على جائزة نوبل للفريتس زيرنيكه في عام 1953، وعلى النقيض تدخل الفرق (DIC) تسمح لمراقبة خلايا ونوى ولكن أيضا الهياكل الفرعية الخلوية بما في ذلك حزم أنيبيب ، الكروموسومات، نويات، وديناميات العضيم، وألياف الأكتين سميكة 12. المشفرة وراثيا البروتينات الفلورية وتطوير الأصباغ الفلورية ضد عضيات أثرت بشكل كبير الوقت الفاصل بين المجهري 13-15. في حين لم يكن التركيز في هذه المادة، والتصوير في الكروية خلية وفي الموقع (intravital المجهري) باستخدام متحد البؤر والفحص المجهري multiphoton تمثل توسع آخر لهذا النهج، وهناك مواد المعلقة التي تستخدم ومناقشة هذه النهج 16-19.
ردود الخلايا لمكافحة كانكونيتم تحديد المخدرات إيه أو المنتجات الطبيعية على المستوى الجزيئي والخلوي. العلاج فهم استجابات الخلايا ومصائر التالية غالبا ما ينطوي على المقايسات سكان المتوسط (على سبيل المثال، immunoblotting، تدابير جيدا الكاملة)، أو الوقت نقطة ثابتة مع كشف مناعي والتدفق الخلوي، التي تقيس الخلايا وحيدة. الاختلاف في استجابة خلية واحدة إلى المخدرات ضمن مجموعة من السكان، ولا سيما في الأورام، قد يفسر بعض التباين في استجابة ينظر عبر خطوط الخلايا والأورام التي يتم التعامل مع نفس الدواء في التشبع. على المدى الطويل نهج طولية لمتابعة خلية واحدة معينة أو مجموعة من الخلايا هو نهج أقل شيوعا ولكنها قوية جدا التي تسمح للدراسة مباشرة لمسارات استجابة الجزيئية، الظواهر المختلفة (على سبيل المثال، موت الخلية أو انقسام الخلية)، ومراقبة تقلب الخلية الى خلية ضمن مجموعة من السكان، وكيف أن هذه العوامل تساهم في ديناميات استجابة السكان 20-22. بتفاؤل، أن تكون قادرةلمراقبة وقياس ردود خلية واحدة سوف تساعد على تحسين فهمنا لكيفية عمل الأدوية، لماذا فشلوا في بعض الأحيان، وكيفية استخدامها أفضل.
تقنية طويلة الأجل الوقت الفاصل بين المجهري، وتتبع الطولي، وتحليل استجابات المخدرات هي متاحة لكثير من المحققين ويمكن أن تكون بسيطة، وذلك باستخدام الضوء فقط تنتقل إلى مراقبة ردود النمط الظاهري 20،21. المكونات الرئيسية لهذا النهج ما يلي: إعداد مناسب من الخلايا من الفائدة، المجهر الآلي مع الغرفة البيئية، متكاملة الكاميرا مع جهاز الكمبيوتر للحصول على وتخزين الصور، وبرامج لإعادة النظر في الوقت الفاصل بين وقياس وتحليل الخلايا وأية أجهزة الاستشعار الفلورسنت. ونحن نقدم بروتوكول مفصلة مع العديد من النصائح لإجراء الفحص المجهري الوقت الفاصل بين الخلايا المستزرعة لطالما عدة أيام باستخدام brightfield و / أو widefield المجهر epifluorescent. ويمكن استخدامها في أي خط الخلية التي يمكن زراعتها في ثقافة هذا البروتوكوللدراسة ردودهم على العلاجات المضادة للسرطان. نحن نقدم أمثلة على البيانات التي حصل عليها وتحليلها باستخدام متعددة مختلفة أجهزة الاستشعار الفلورسنت المشفرة وراثيا ومثال على المرحلة المجهري على النقيض، ومناقشة لفترة وجيزة أنواع مختلفة من تحقيقات، ومزايا وعيوب على المدى الطويل الوقت الفاصل بين وتتبع الطولي، ما يمكن أن يكون علمت لهذا النهج الذي يصعب فهمه من النهج غير المباشرة، وبعض الاختلافات التي نأمل أن تكون ذات فائدة وقيمة للباحثين عديمي الخبرة الذين لا يعتبر استخدام هذا النهج، والباحثين من ذوي الخبرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
مزايا المجهري الوقت الفاصل بين وتتبع طولية
المجهر هو أداة مثالية للدراسات طولية من الاستجابة للدواء كما أنه يسمح للمحققين لتعقب الخلايا الفردية ومصائرهم وكذلك السكان. التغير في الاستجابة للدواء ضمن مجموعة من الخلايا ه…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Materials
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
Referências
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
- Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
- van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, . Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
- Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
- Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
- Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
- Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
- Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
- Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
- Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
- Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
- Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
- Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
- Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
- Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
- Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
- Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
- Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
- Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
- Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
- Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
- Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
- Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- D’Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
- Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
- Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
- N’Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
- Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
- Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
- Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
- Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
- Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
- Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
- Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
- Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., Robinson, J. .. . P. a. u. l., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. 66, (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
- Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
- Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).
