鏡の国のアリス：単一細胞のタイムラプス顕微鏡と縦トラッキング抗がん治療薬を研究します
Summary
Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Abstract
抗癌剤への単一細胞の応答は、集団の応答を決定する際に有意に寄与し、したがって、全体的な結果の主要な要因です。イムノブロッティングは、フローサイトメトリーおよび固定細胞実験は、多くの場合、細胞が抗がん剤への対応方法を研究するために使用されています。これらのメソッドは重要ですが、彼らはいくつかの欠点を持っています。癌細胞と正常細胞の間で、異なるがん由来の細胞、および過渡希応答の間の薬物応答における変動性は、集団平均化アッセイを使用して直接追跡し、長手方向にそれらを分析することができることなく理解することは困難です。顕微鏡は、画像の生細胞に特に適しています。技術の進歩だけでなく、細胞の追跡だけでなく、様々な細胞応答の観察を可能解像度で日常画像セルに私たちを有効にします。私たちは、の連続タイムラプスイメージングを可能にする詳細なアプローチについて説明します基本的に限り、一般的に96時間まで、所望のようにのための薬剤応答中に細胞。アプローチのバリエーションを使用して、細胞が週間モニターすることができます。遺伝的にコード化された蛍光バイオセンサーの採用により多数のプロセス、経路および応答が続くことができます。我々は、追跡し、細胞増殖および細胞周期進行、染色体ダイナミクス、DNA損傷の定量化、および細胞死を含む例を示します。我々はまた、技術とその柔軟性のバリエーションを議論し、いくつかの一般的な落とし穴を強調表示します。
Introduction
単一細胞の生細胞の顕微鏡縦追跡は新しい技術ではありません。最古の顕微鏡から、愛好家や科学者は、単一の細胞および生物、彼らの行動、および開発1-3を観察し、研究しています。 1950年代のバンダービルト大学の後期のデビッド・ロジャースからの有名な例は、 黄色ブドウ球菌の菌と食作用4の最終的過程を追いかけて血液塗抹標本中のヒト好中球を示しています。化学勾配の検知、力学および細胞運動性、細胞の形状のダイナミクス、接着、および病原体の食作用の速度：この生細胞ムービーは、単一の実験で観察され、相関させることができるか、複数のプロセスの優れた説明図です。
完全に自動化された顕微鏡や高感度デジタルカメラの出現がfの範囲の細胞生物学の基本的な質問をするために顕微鏡を用いて研究者数の増加をもたらしました細胞は5,6を移動し、ダイナミクスや膜輸送9-11をオルガネラする7,8分割の仕方ROM。 1953年にフリッツ・ゼルニケのためのノーベル賞を獲得し、位相コントラスト（PC）を含む非蛍光、明視野顕微鏡、、、および微分干渉コントラスト（DIC）は、微小管の束を含む細胞および核だけでなく、サブ細胞構造の観察を可能に、染色体、核小体、細胞小器官ダイナミクス、太いアクチン繊維12。遺伝的にコードされる蛍光タンパク質や細胞小器官に対する蛍光色素の開発が飛躍的にタイムラプス顕微鏡13-15に影響を与えています。この記事の焦点ではないが、共焦点および多光子顕微鏡を用いて細胞スフェロイドにおけるその場 （生体顕微鏡） で撮像がアプローチの別の拡大を表しており、使用してこれらのアプローチを16-19を議論する優れた記事があります。
抗CANCに対する細胞の応答えー薬または天然物は、分子や細胞スケールで決定されます。治療後の細胞応答と運命を理解することは、多くの場合、免疫蛍光検出に人口平均化アッセイ（ 例えば 、免疫ブロット法、全ウェル対策）、または固定の時点を含み、単一の細胞を測定する、フローサイトメトリー。集団内の薬物への単一細胞応答の不均一性は、腫瘍において特に飽和で同じ薬物で処置された細胞株および腫瘍全体で見られる応答の変動のいくつかを説明することができます。指定された単一の細胞または細胞の集団を追跡する縦のアプローチ長期的には、分子応答経路の直接的な研究を可能にするあまり一般的ではないが、非常に強力なアプローチである、の異なる表現型（ 例えば 、細胞死や細胞分裂）、観察細胞と細胞の集団内で変動し、どのようにこれらの要因は、人口の応答ダイナミクス20-22に貢献しています。楽観的、できること単一細胞の反応を観察し、定量化するためには、薬物は、彼らが時々失敗する理由、仕事、そしてどのように最高のそれらを使用する方法の我々の理解を向上させるのに役立ちます。
長期的タイムラプス顕微鏡、縦追跡、および薬物応答の解析の手法は、多くの研究者に利用可能であると表現型の応答20,21を観察する透過光のみを使用して、シンプルにすることができます。アプローチの主なコンポーネントは以下のとおりです。目的の細胞の適切な準備、環境室と自動顕微鏡、画像を取得し、保存するためのコンピュータと一体化したカメラ、および時間経過と対策を検討し、細胞を分析するためのソフトウェアを任意の蛍光バイオセンサー。私たちは、明視野および/または広視野落射蛍光顕微鏡を使用している限り、数日間培養した細胞のタイムラプス顕微鏡検査を行うための多くのヒントを詳細なプロトコルを提供します。このプロトコールは、培養で増殖させることができる任意の細胞株のために使用することができます抗癌治療への応答を研究します。我々は、取得したデータの例を提供し、複数の異なる遺伝的にコードされた蛍光バイオセンサーおよび位相差顕微鏡の例を用いて分析し、簡単に何をすることができ、プローブの異なる種類の、長期の時間経過、縦トラッキングの長所と短所を議論します非直接アプローチ、そして我々はアプローチを使用して考えていない経験の浅い研究者、および経験豊富な研究者に興味や価値があることを願っていますいくつかのバリエーションから理解することは困難である。このアプローチを学びました。
Protocol
Representative Results
Discussion
タイムラプス顕微鏡と縦トラッキングのメリット
それは研究者が個々の細胞とその運命だけでなく、全人口を追跡することを可能にするよう顕微鏡は、薬剤応答の縦断的研究のための理想的な楽器です。細胞の集団内で薬物応答における変動は、抗癌治療設計のための主要な問題です。単一細胞の長手方向の追跡は、研究者がこの変動を観察し、それが細?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Materials
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
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