Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro
Summary
Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Abstract
La risposta di singole cellule di farmaci anti-cancro contribuiscono a determinare la risposta della popolazione, e quindi è un importante fattore nel risultato complessivo. Immunoblotting, citometria a flusso e esperimenti sulle cellule fisse sono spesso utilizzati per studiare come le cellule rispondono ai farmaci anti-cancro. Questi metodi sono importanti, ma hanno diversi difetti. La variabilità della risposta ai farmaci tra il cancro e cellule normali, e tra le cellule di origine diversa cancro, e transitori e le risposte rare sono difficili da capire usando saggi popolazione calcolo della media e senza essere in grado di monitorare direttamente e analizzarli in senso longitudinale. Il microscopio è particolarmente adatto a cellule vive di immagine. Gli avanzamenti nella tecnologia ci permettono di ordinariamente celle di immagine con una risoluzione che consente non solo di inseguimento cellulare, ma anche l'osservazione di una varietà di risposte cellulari. Descriviamo un approccio in dettaglio che permette di imaging continuo time-lapse dicellule durante la risposta ai farmaci essenzialmente per il tempo desiderato, in genere fino a 96 ore. Utilizzando varianti dell'approccio, le cellule possono essere monitorati per settimane. Con l'impiego di organismi geneticamente codificati biosensori fluorescenti processi numerosi, i percorsi e le risposte possono essere seguite. Mostriamo esempi che includono il monitoraggio e la quantificazione della crescita cellulare e la progressione del ciclo cellulare, la dinamica dei cromosomi, danni al DNA, e la morte cellulare. Discuteremo anche le variazioni della tecnica e la sua flessibilità, e mettere in evidenza alcuni problemi comuni.
Introduction
microscopia Live-cell e il monitoraggio longitudinale di singole cellule, non è una nuova tecnica. Fin dai primi microscopi, gli appassionati e gli scienziati hanno osservato e studiato singole cellule e organismi, i loro comportamenti, e lo sviluppo 1-3. Un esempio famoso della fine del David Rogers alla Vanderbilt University nel 1950 mostra un neutrofili umano in uno striscio di sangue a caccia di un batterio Staphylococcus aureus e, infine, il processo di fagocitosi 4. Questo film live-cell è un eccellente esempio di come i processi multipli possono essere osservati e correlati in un singolo esperimento: rilevamento di un gradiente di chimica, la meccanica e la velocità della motilità cellulare, cellule forme dinamiche, l'adesione e la fagocitosi di un agente patogeno.
L'avvento di microscopi completamente automatizzati e fotocamere digitali ad alta sensibilità ha portato ad un crescente numero di ricercatori che utilizzano la microscopia di porre domande fondamentali nel campo della biologia delle cellule che vanno from come le cellule si muovono 5,6 e 7,8 per dividono organelli dinamica e traffico di membrana 9-11. Non fluorescente, in campo chiaro microscopia, tra cui contrasto di fase (PC), che ha ottenuto il premio Nobel per Frits Zernike nel 1953, e il contrasto di interferenza differenziale (DIC) consentire l'osservazione di cellule e nuclei ma anche strutture sub-cellulari, tra cui fasci microtubuli , cromosomi, nucleoli, dinamica organelli, e fibre di actina spessore 12. Geneticamente codificato proteine fluorescenti e lo sviluppo di coloranti fluorescenti contro organelli hanno notevolmente influenzato time-lapse microscopia a 13-15. Pur non essendo il focus di questo articolo, l'imaging in sferoidi di cellule e in situ (microscopia intravitale) utilizzando la microscopia confocale e multiphoton rappresentano un'altra espansione dell'approccio, e non ci sono articoli in sospeso che usano e trattano questi approcci 16-19.
Le risposte delle cellule di anti-cancfarmaci er o prodotti naturali sono determinate sulla scala molecolare e cellulare. Comprensione delle risposte cellulari e sorti in seguito al trattamento spesso comporta saggi popolazione della media (ad es., Immunoblotting, misure e integrali), o il tempo-punti fissi con il rilevamento di immunofluorescenza e citometria a flusso, che misurano singole cellule. L'eterogeneità nelle risposte delle cellule singole a farmaci all'interno di una popolazione, in particolare nei tumori, può spiegare alcune delle variabilità nella risposta visto attraverso le linee cellulari e tumori che vengono trattati con lo stesso farmaco a saturazione. A lungo termine approcci longitudinali seguire una determinata cella singola o di una popolazione di cellule è un approccio meno comune ma molto potente che consente lo studio diretto di percorsi risposta molecolare, diversi fenotipi (ad es., Morte cellulare o divisione cellulare), osservazione cella-a-cella di variabilità all'interno di una popolazione, e come questi fattori contribuiscono alla dinamica di risposta della popolazione 20-22. Ottimisticamente, essendo in gradodi osservare e quantificare le risposte delle cellule singole contribuirà a migliorare la nostra comprensione di come funzionano le droghe, il motivo per cui a volte falliscono, e come li utilizzano al meglio.
La tecnica di lungo termine microscopia time-lapse, il monitoraggio longitudinale, e l'analisi delle risposte farmaco è disponibile per molti ricercatori e può essere semplice, utilizzando solo la luce trasmessa per osservare le risposte fenotipo 20,21. I componenti principali del metodo sono: la corretta preparazione delle cellule di interesse, un microscopio automatizzato con camera ambientale, una fotocamera integrata con un computer per acquisire e memorizzare le immagini, e il software di rivedere il time-lapse e misurare e analizzare le cellule e qualsiasi biosensori fluorescenti. Forniamo un protocollo dettagliato con molti suggerimenti per lo svolgimento di time-lapse microscopia di cellule in coltura per tutto il tempo diversi giorni con campo chiaro e / o la microscopia epifluorescente widefield. Questo protocollo può essere utilizzato per qualsiasi linea cellulare che può essere coltivata in colturaper studiare le loro risposte alle terapie anti-cancro. Forniamo esempi di dati acquisiti e analizzati utilizzando più biosensori fluorescenti geneticamente codificati diversi e un esempio di microscopio a contrasto di fase, discutere brevemente i diversi tipi di sonde, i vantaggi e gli svantaggi di lungo termine time-lapse e il monitoraggio longitudinale, ciò che può essere imparato a questo approccio che è difficile da capire da approcci non-diretti, e alcune variazioni che speriamo essere di interesse e valore per i ricercatori inesperti che non hanno pensato di utilizzare l'approccio, e di ricercatori esperti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vantaggi di Microscopia time-lapse e monitoraggio longitudinale
Il microscopio è uno strumento ideale per gli studi longitudinali di risposta ai farmaci in quanto consente ai ricercatori di monitorare le singole cellule e il loro destino, nonché l'intera popolazione. La variabilità della risposta ai farmaci all'interno di una popolazione di cellule è una questione importante per l'anti-cancro disegno terapeutico. monitoraggio longitudinale di singole cellule …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Materials
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
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