유리를 통해 보면 : 시간 경과 현미경 및 단일 세포의 종 추적 항암 치료를 공부하기
Summary
Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Abstract
항암제에 대한 단 전지의 반응은 모집단 응답을 결정하는데 크게 기여하고, 따라서 전체 결과에서 중요한 요인이다. 면역은 유동 세포 계측법 고정 세포 실험은 종종 세포가 항암제에 반응하는 방법을 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 방법은 중요하지만, 몇 가지 단점이 있습니다. 암과 정상 세포간에, 다른 암 유래의 세포 및 과도 희귀 응답 사이의 약물 반응의 다양성 인구 평균 어 세이를 이용하여 직접 추적 종을 분석 할 수없이 이해하기 어렵다. 현미경은 특히 이미지 살아있는 세포에 적합합니다. 기술의 발전뿐만 아니라 세포 추적뿐만 아니라, 세포 반응의 다양한 관찰을 가능하게하는 해상도에서 일상적으로 이미지 세포에 우리를 가능하게한다. 우리의 연속적인 시간 경과 이미징을 허용 자세히 접근 방식을 설명기본적으로 한 일반적으로 96 시간까지 원하는대로에 대한 약물 반응 동안 세포. 접근 방법의 변형을 사용하여, 세포 주에 대해 모니터링 될 수있다. 유전자 인코딩 된 형광 바이오 센서 수많은 프로세스, 경로 및 응답의 고용으로 이어 할 수 있습니다. 우리는 추적 및 세포 성장 및 세포주기 진행 염색체 역학, DNA 손상의 정량화 및 세포 사멸 등을 실시 예를 나타낸다. 우리는 또한 기술과 유연성의 변화를 토론하고 몇 가지 일반적인 함정을 강조 표시합니다.
Introduction
라이브 세포 현미경 단셀 길이 추적 새로운 기술이 아니다. 최초의 현미경에서 매니아와 과학자들은 하나의 세포와 생물, 자신의 행동, 개발 1-3을 관찰하고 연구 하였다. 1950 년대에 밴더빌트 대학에서 후반 데이비드 로저스에서 유명한 예는 황색 포도상 구균 박테리아와 식균 작용 (4) 결국 프로세스를 쫓는 혈액 도말 검사에서 인간의 호중구를 보여줍니다. 이 라이브 셀 영화는 하나의 실험에서 관찰하고 상관 관계를 할 수있는 방법을 여러 프로세스의 우수한 그림이다 : 화학 그라데이션, 역학 및 세포 운동의 속도를 감지, 세포 역학, 접착 및 병원체의 식균 작용을 형성한다.
완전 자동화 현미경 고감도 디지털 카메라들의 출현은 세포 생물학 F까지의 기본적인 질문을 현미경을 사용하여 연구자의 수가 증가 가져왔다세포가 5,6를 이동하고 역학 및 멤브레인 인신 매매 9-11 소기관에 7,8를 분할하는 방법 롬. 비 형광, 1953 년 프리츠 제르 니커의 노벨상을 얻고 위상차 (PC), 미분 간섭 대비를 포함하여 시야 현미경 (DIC) 미세 소관 번들을 포함한 세포와 핵뿐만 아니라 하위 세포 구조의 관찰을 허용 , 염색체, 핵소체, 세포 기관 역학, 두꺼운 액틴 섬유 (12). 유전자 형광 단백질을 인코딩 및 세포 소기관에 대한 형광 염료의 개발은 극적으로 시간 경과 현미경 13-15 영향을하고있다. 이 기사의 초점이 아니라 동안, 세포 타원체와 현장 (생체 내에 현미경) 공 초점 및 광자 현미경을 사용하여 이미징은 접근의 또 다른 확장을 나타내고, 사용하고 이러한 방법 16-19을 논의 뛰어난 기사가있다.
안티 canc에 대한 세포의 반응어 약물이나 천연 제품은 분자 및 세포 규모에 따라 결정됩니다. 이해 세포 반응과 운명 다음 치료는 종종 단일 세포 측정 인구 평균 분석 (예., 면역, 전체 잘 측정), 또는 면역 형광 검출에 고정 된 시간 지점 및 유동 세포 계측법을 포함한다. 집단 내의 약물 단일 세포 반응의 이질성은 종양, 특히 포화에서 동일한 약제로 처리 된 세포주와 종양을 본 반응 다양성의 일부를 설명 할 수있다. 주어진 단일 셀 또는 셀의 인구를 따르지 세로 방법 장기 분자 반응 경로의 직접적인 연구 할 수있는 덜 일반적인하지만 매우 강력한 방법입니다, 서로 다른 표현형 (예., 세포 사멸 또는 세포 분열), 관찰 세포 간 집단 내의 변화 방법 및 이러한 요소 인구 응답 20-22 역학에 기여한다. 낙관적, 수있는관찰과 약물들이 종종 실패하는 이유, 작동, 및 최선의 방법을 사용하는 방법에 대한 우리의 이해를 개선하는 데 도움이됩니다 단일 세포 반응을 정량화한다.
장기적으로 시간 경과 현미경, 종 추적 및 약물 반응의 분석 기술은 많은 연구자에 사용할 수 있으며 표현형 응답 (20, 21)을 관찰하기 만 투과광을 이용하여 간단 할 수있다. 접근법의 주요 구성 요소는 : 관심있는 세포의 적당한 제제 환경 챔버와 자동화 현미경, 카메라가 획득 및 시간 경과를 검토 할 이미지를 저장하고, 소프트웨어를 측정하고, 세포를 분석하는 컴퓨터로 통합 및 형광 바이오 센서. 우리는 시야 및 / 또는 위드 epifluorescent 현미경을 사용하여만큼 몇 일 동안 배양 된 세포의 시간 경과 현미경을 수행하기위한 많은 조언과 자세한 프로토콜을 제공합니다. 배양에서 성장 될 수있는 임의의 세포주를 사용할 수있다이 프로토콜항암 치료에 대한 자신의 반응을 연구합니다. 우리는 수집 된 데이터의 예를 제공하며, 간단하게 다른 프로브 타입의 장점과 장기간 경과 및 종 추적 단점 논의 상이한 유전자 부호화 형광 바이오 센서 및 위상차 현미경의 일례를 분석하여, 어떤 일 수 비 – 직접 접근, 우리가 접근 방식을 사용하여 고려하지 않은 경험이 연구자들에게 관심과 가치가있을 것입니다 희망 약간의 변화에서 이해하기 어려운, 경험이 풍부한 연구자하다이 방법에 대해 배웠습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
시간 경과 현미경 및 종 추적의 장점
이 연구자들은 각 셀 그들의 운명뿐만 아니라 전체 모집단을 추적 할 수 있도록, 상기 현미경은 약물 반응 종의 연구를위한 이상적인 도구이다. 세포 집단 내에서 약물 반응의 다양성은 항암 치료 설계를위한 중요한 문제입니다. 단일 세포의 종 추적 수사관이 변화를 관찰하고 세포 인구에 관한로서 기본 메커니즘과 결과를 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Materials
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
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