סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול
Summary
יש תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) את היכולת הפנימית להבדיל עצמי לארגן לתוך דפוסי רקמה ייחודיים; אם כי זה דורש ההצגה הדרגתית סביבה המרחבית. אנו מציגים סטנסיל micropatterning כשיטה פשוט חזקה כדי ליצור הדרגתי ביוכימיות מכאניות לשליטת דפוסי בידול hPSC.
Abstract
Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.
Introduction
תאי גזע פלוריפוטנטיים האדם (hPSCs), כולל תאי גזע עובריים (hESCs) ותאי גזע מושרים (hiPSCs), מנוצלים נרחב ברפואה רגנרטיבית וכן מודלים ניסיוניים של organogenesis בריאים וחולים בגלל פוטנציאל הבידול שלהם לתוך שושלות תאים של כל שלוש שכבות ניבטות 1,2. גורלן הבידול של hPSCs רגיש מאוד גורמים סביבתיים מקומיים שיכול לווסת autocrine או paracrine איתות 1 כמו גם תהליכי mechanotransduction בתיווך רמזים פיסיים 3-5. Micropatterning הסלולרי מקיף קבוצה של טכניקות פותחו כדי לארגן את הגיאומטריה ומיקום מרחבית של אוכלוסיית תא כאמצעי לשלוט microenvironment הסלולר המקומי, כגון תאי תאי אינטראקציות 6 ואינטראקציות-מטריקס 3 תאים. בהקשר של hPSCs, תא micropatterning הועסק כדי לקבל תובנות משמעותיות לתוך איך נישה-תלוייםאיתות autocrine אף אוזן גרון מודולציה החלטות בידול-pluripotency hESC 7 וארגון לתוך דפוסי הבידול עובריים מוקדם 6. HPSCs micropatterned 2D and 3D שמש לשלוט בגודל המושבה של דפוסים רבים-תאיים, אשר בתורו השפיעו החלטות בידול לשלוש השכבות ניבטו 8,9. יש לנו עובדים micropatterns hPSC רב-תאיים לווסת את מידת תאים תאים ואינטראקציות תא-מטריקס בתוך המושבה hPSC לחקור כיצד integrin-E-cadherin crosstalk יכול להצמיח ההטרוגניות גורל התא 10. ההפגנות מן האפיקים החדשים הפתוחים דוחות מעל לקראת היישום של micropatterns הרב-תאיים של hPSCs כמודלים ניסיוניים להקרנת תרופה רעילה למחלות התפתחותיות 11, כדי לחקור את ההשפעה של גורמי גדילה והורמונים במהלך רקמות או התפתחות איברים, וכדי לפתור את ההיווצרות דפוסי רקמה.
מספר עצום של תאים micropatterטכניקות נינג פותחו כפי שנסקרו על ידי Falconnet et. al. 12 אבל רק קומץ, כגון מגע מיקרו הדפסת 7,8,13, תרבות microwell 14,15, photopatterning 6 ו microstencils 16 יושמו בהצלחה עם hPSCs. האתגר עם hPSCs micropatterning טמון פגיעותם ודרישה מחמירה של מטריצות תאיות ספציפיות (ECM) ותנאי צמיחה עבור התקשרות לתא והישרדות. דפוסי 2D hPSC, הדפסת מייקרו מגע היא אחת השיטות הנפוצות ביותר כדי ליצור micropatterns hPSC על מצעי תרבות זכוכית רקמות 13. השיטה יכולה לשמש כדי ECM משותף דפוס המשמש בתרבות hPSC, לרבות מטריצות הממברנה laminin ומרתף, כגון Matrigel. עם זאת, בדרך כלל זה דורש תהליך ציפוי שני שלבים שנעזר Poly-D- ליזין, ועליו תנאים אטמוספריים ולחות אינרטי ספציפיים לעשות micropatterns ECM יציב hPSCs לצרף על 6,13. התמורה ובראשונה של כל שיטת micropatterning היא האם משטר שינוי פני השטח יכול ליצור דפוסי ECM hPSC-דבקים ברזולוציה הגיאומטרית הרצויה תוך מזעור מצורף תא נוקב אל בסביבותיה.
כאן אנו מדווחים על שימוש סטנסיל micropatterning כשיטה פשוטה ליצור micropatterns hPSC ללא צעדים שינוי פני השטח נוספים לפני דור דפוסי ECM דבק hPSCs לצרף על. סטנסיל התא מורכב של קרום דק, למשל, polydimethylsiloxane (PDMS) גיליון, עם מיקרון מילימטר גודל דרך נקבי חתום על מצע תרבית תאים להכיל ציפוי ECM פיזית ובהמשך hPSCs הזורע. כמו דפוסי סטנסיל עובדים פיזית ירסנו את המיקום שבו hPSC יכול לגשת ולצרף ישירות למצע ECM המצופה הבסיסי, שיטה זו היא תואמת עם מצעים שונים שיכול לתמוך תרבויות hPSC. Requiremen רקt הוא כי הבחירה של חומר סטנסיל יכולה ליצור חותם הפיך עם המצע. מצעים אלה כוללים קלקר בתרבית רקמה קונבנציונלי (TCPS) 17, מצעי מצומדות ליגנד 18, כמו גם מצעים אלסטומרי עם קשיחות מתכוננת (למשל., PDMS) 19. שיטה זו גם מאפשרת ציפוי של ECM שונים, כגון vitronectin (או חלבון VTN), laminin ומטריצות קרום במרתף (למשל, Matrigel ו Geltrax) כדי לאפשר התקשרות נאותה והבחנה של hPSCs. לכן, אנחנו יכולים להעביר אופטימיזציה תצורות ECM-מצע עבור קו hPSC ספציפי שבלונת micropatterning הידבקות, הישרדות התמיינות תאים-מטריקס אופטימלית. לאחרונה, בשיטה דומה גם דווחה לכוון בידול הכבד על ידי hESCs micropatterning באמצעות פולי (methacrylate מתיל) (PMMA) מערכים-סטנסיל מיקרו 16.
סטנסילים ניידים יכולים להיות מפוברקים מחומרים שונים, לרבות נפגשו als 20,21, פולי (p-xylylene) פולימרים 22,23, PMMA 16 והכי נפוץ, PDMS 24-28. סיליקון פולי (p-xylylene) סטנסילים פולימרים דורשים תחריט הישיר של החורים דרך עם ציוד מיוחד 20-23, אשר מגביל הנגישות שלהם למשתמשים ביולוגיים. סטנסילים PDMS יכול להיות מפוברק על ידי שיטות שונות בהתאם לגודל המאפיין הרצוי, אשר בדרך כלל נע בין 3 מיקרומטר 2,000 מיקרומטר 11,26-29. אם תכונות קטנות הן רצויות, גיליונות שכפולים רזה יכולים להיות מיוצרים על ידי דפוס עיתונות PDMS מראש פולימר על תבנית סיליקון microfabricated המכילה תבליטים של micropatterns 28. עבור תכונות> 1,000 מיקרומטר, חותך ליזר CO 2 מספק שיטת עלות קלה ונמוכה לחתוך את הדפוסים ישירות על גיליון מראש casted PDMS במהלך ייצור סטנסיל. המחזור של סטנסילים PDMS גם גורם להם חסכוני לבצע סדרה של ניסויים עם עקביות מספיק.
<p clהתחת = "jove_content"> כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה מפורט על המצאה של סטנסיל PDMS עם 1,000 מיקרומטר תכונות ידי חיתוך לייזר דור micropatterns hESC. Micropatterns hESC אלה שימשו כדי לווסת את מידת integrin ו- E-cadherin בתיווך הידבקויות תוך מושבה hESC מלוכדת כדי לחקור כיצד הקיטוב המרחבי של הידבקות התא הביאה ההטרוגניות גורל התא 10.Protocol
Representative Results
Discussion
המצאה של סטנסילים micropatterning
micropatterning סטנסיל מספק שיטה אידיאלית ליצור hPSC micropatterns על חקירת דפוסי בידול בתיווך נישה. היתרון העיקרי של דפוסים סטנסיל על פני שיטות micropatterning אחרות, כגון הדפסת microcontact ו photopatterning, הוא שהיא אינה …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי NUS להתחלה מענק (R-397-000-192-133) ו ETPL גאפ קרן (R-397-000-198-592). GS הוא חוקר NUS. מחברים מבקשים להודות לד"ר Jiangwa Xing לקבלת התמיכה הטכנית שלה על micropatterning תא.
Materials
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 Cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 Cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
Referências
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50, 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
