Stencil micromodelage des pluripotentes humaines Cellules souches pour Probing Organisation spatiale des Différenciation Fates

Summary

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont la capacité intrinsèque de différencier et d'auto-organisation dans des modèles de tissus distincts; bien que cela nécessite la présentation des gradients environnementaux spatiales. Nous présentons stencil micromodelage comme une méthode simple et robuste pour générer des gradients biochimiques et mécaniques pour le contrôle des motifs de différenciation HPSC.

Abstract

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Introduction

Les cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires (CSEh) et induites des cellules souches pluripotentes (de hiPSCs), sont largement exploités dans la médecine régénérative ainsi que la modélisation expérimentale de l'organogenèse normaux et malades en raison de leur potentiel de différenciation en lignées cellulaires de tous trois couches de germe ^1,2. Les destins de différenciation des hPSCs sont très sensibles à des facteurs environnementaux locaux qui peuvent moduler les processus de mécanotransduction autocrine ou de signalisation ¹ paracrines ainsi que médiées par des indices physiques ^3-5. Cellule micromodelage englobe un ensemble de techniques qui ont été développées pour organiser spatialement la géométrie et l' emplacement d'une population de cellules comme un moyen de contrôler le microenvironnement cellulaire local, tels que les interactions cellule-cellule ⁶ et interactions cellule-matrice ^3. Dans le contexte de hPSCs, micromodelage cellulaire a été utilisé pour acquérir des connaissances importantes sur la façon dont niche dépendentsignalisation autocrine ent modulant CSEh décisions pluripotence-différenciation ⁷ et de l' organisation dans des schémas de différenciation embryonnaires ^6. 2D et 3D hPSCs microélectrodes ont été utilisées pour contrôler la taille des colonies multicellulaires de motifs, ce qui a influencé les décisions de différenciation dans les trois couches de germe ^8,9. Nous avons employé micropatterns HPSC multicellulaires pour moduler l'ampleur de la cellule-cellule et les interactions cellule-matrice au sein d' une colonie HPSC pour sonder la façon intégrine E-cadhérine diaphotie peut donner lieu à devenir cellulaire hétérogène ^10. Les démonstrations des rapports ci – dessus ouvrent de nouvelles avenues vers l'application de micropatterns multicellulaires de hPSCs comme modèles expérimentaux pour le dépistage de la toxicité des médicaments pour les maladies de développement ^11, pour étudier l'effet des facteurs de croissance et des hormones pendant les tissus ou le développement des organes, et à démêler la formation de des motifs de tissus.

Une myriade de micropatter cellulairetechniques ning ont été développés comme examinés par Falconnet et. al. , ¹² mais seulement une poignée, comme les micro-impression par contact ^7,8,13, la culture de micropuits ^14,15, photopatterning ⁶ et microstencils ¹⁶ ont été mises en œuvre avec succès avec hPSCs. Le défi avec hPSCs de micromodelage réside dans leur vulnérabilité et une exigence stricte des matrices spécifiques extracellulaires (ECM) et des conditions de croissance pour la fixation et la survie cellulaire. Pour les modèles 2D HPSC, l' impression micro-contact est l' une des méthodes les plus courantes pour générer micropatterns HPSC sur culture de tissus et de verre substrats ^13. La méthode peut être utilisée pour modèle ECM commun utilisé dans la culture HPSC, y compris la laminine et la membrane basale matrices, comme Matrigel. Cependant, elle nécessite généralement un procédé de revêtement en deux étapes aidé par Poly-D-Lysine, et a besoin de conditions atmosphériques et d' humidité inertes spécifiques pour rendre micropatterns ECM stables pour hPSCs pour fixer sur ^6,13. La première considération de chaque méthode de micromodelage est de savoir si le régime de modification de surface peut générer des motifs d'ECM HPSC-adhésives à la résolution géométrique souhaitée, tout en minimisant l'attachement des cellules non spécifiques aux zones environnantes.

Nous rapportons ici l'utilisation du pochoir micromodelage comme une méthode simple pour générer micropatterns HPSC sans étapes de modification de surface supplémentaires avant la génération de modèles ECM adhésifs pour hPSCs pour fixer sur. Le pochoir de cellules se compose d'une membrane mince, par exemple, les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS) en feuilles, avec micron au millimètre taille des trous traversants fermés sur un substrat de culture de cellules pour contenir physiquement les revêtements de l' ECM et hPSCs ensuite ensemencés. Pochoir comme motif fonctionne en empêchant physiquement l'endroit où HPSC peut accéder et fixer directement sur le substrat enduit sous-jacent ECM, cette méthode est compatible avec différents substrats qui peuvent supporter des cultures HPSC. Les seuls requirement est que le choix du matériau de pochoir peut former un joint réversible avec le substrat. Ces substrats comprennent le polystyrène classique de culture tissulaire (EPTC) ^17, des substrats conjugués ligand ^18, ainsi que des substrats élastomères avec une rigidité réglable (par ex., Le PDMS) ^19. Cette méthode permet également le revêtement d'ECM différents, tels que la vitronectine (ou protéine VTN), la laminine et les matrices de la membrane basale (par exemple Matrigel et Geltrax) pour permettre la fixation et la différenciation des hPSCs appropriée. configurations ECM-substrat Par conséquent, nous pouvons transférer optimisés pour une ligne HPSC spécifique au pochoir micromodelage pour optimiser la cellule-matrice adhérence, la survie et la différenciation. Récemment, une méthode similaire a également été signalé pour diriger la différenciation hépatique par CSEh micromodelage utilisant le poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA) des réseaux de micro-pochoirs ^16.

pochoirs cellulaires peuvent être fabriqués à partir de matériaux différents, y compris rempliesals ^20,21, le poly (p-xylylène) les polymères ^22,23, PMMA ¹⁶ et le plus souvent, le PDMS ^24-28. Le silicium et le poly (p-xylylène) polymères pochoirs nécessitent la gravure directe des trous traversants avec des équipements spécialisés ^20-23, ce qui limite leur accessibilité aux utilisateurs biologiques. PDMS pochoirs peuvent être fabriqués par différentes méthodes en fonction de la taille de la fonction requise, ce qui est généralement compris entre 3 um à 2000 um ^11,26-29. Si de petites caractéristiques sont souhaitées, de minces feuilles de pochoir peuvent être produites par moulage à la presse PDMS de pré-polymère sur un gabarit de silicium micro – usiné comportant des reliefs de micromotifs ^28. Pour connaître les caractéristiques> 1000 um, un cutter laser CO ₂ offre une méthode simple et peu coûteux de réduire directement les motifs sur une feuille PDMS pré-coulé lors de pochoir fabrication. La recyclabilité des pochoirs PDMS rend également rentable de mener une série d'expériences avec une consistance suffisante.

<p class = "jove_content"> Ici, nous présentons la méthodologie détaillée pour la fabrication d'un pochoir de PDMS avec 1000 um caractéristiques par découpe laser et la génération de micropatterns CSEh. Ces micropatterns hESC ont été utilisés pour moduler l'ampleur de l' intégrine et la E-cadhérine au sein médiées adhérences une colonie de hESC cohérente afin d'étudier la façon dont la polarisation spatiale de l' adhésion cellulaire a entraîné le destin des cellules ¹⁰ hétérogénéité.

Protocol

NOTE: Ce protocole décrit la fabrication de PDMS pochoir avec 1000 um modèles par découpe au laser et micromodelage de la ligne de CSEh, H9 utilisant le pochoir PDMS. 1. Conception et fabrication de PDMS Stencil pour micromodelage Concevoir la feuille de pochoir avec trous traversants de la géométrie désirée et la taille (par exemple, 1000 pm cercles) et le joint de pochoir à l' aide du logiciel conception assistée par ordinateur 10. Lase…

Representative Results

Dans cet article, nous décrivons la fabrication d'un pochoir de cellule en utilisant un cutter laser pour générer 1000 um caractéristiques. Le pochoir est composé de 2 parties: une feuille de pochoir mince (environ 100-200 um d'épaisseur) contenant le Microdétail trous traversants, et un joint de PDMS pour contenir la solution de revêtement ECM ou d'une suspension cellulaire. Ici, 127 um et 2 mm d'épaisseur des feuilles PDMS disponibles dans le commerce ont été…

Discussion

Fabrication de pochoirs micromodelage

micromodelage Stencil fournit une méthode idéale pour générer micropatterns HPSC pour enquêter sur niche médiée différenciation patterning. L'avantage principal du pochoir formation de motifs par rapport aux autres techniques de micromodelage, telles que l'impression par microcontact et photopatterning, est qu'il ne nécessite pas de modification de la surface et peut être mis en oeuvre sur des substrats EPT…

Materials

2 mm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.005	Used to form reservoir for stencil
120-150 μm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.040	Used to form stencil
60 mm petri dish	Nunc Nunclon Delta	150326	Substrate for micropatterning
Accutase	Accutase, Merck Millipore, Singapore	SCR005	Enzyme to break H9 Cells into single cells
Activin	R&D Systems, Singapore	338-AC-010	Growth factor for H9 differentiation
BMP4	R&D Systems, Singapore	338-BP-010	Growth factor for H9 differentiation
Plasma system	Femto Science, Korea	CUTE-MP	For plasma oxidation of stencil
Dispase	StemCell™ Technologies, Singapore	7923	Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12	GIBCO, USA	11330032	Basal medium for H9 cells
FGF2	R&D Systems, Singapore	233–FB–025	Growth factor for H9 differentiation
H9 Cell line	WiCell Research Institute, Inc., USA	WA09	Human embryonic stem cells
hESC-qualified basement membrane matrix	Matrigel, BD Biosciences, Singapore	354277	Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells
Inverted microscope	Leica Microsystems, Singapore	DMi1	For capturing bright-field images
Laser cutter	Epilog Helix 24 Laser System		Used to generate through holes in PDMS sheet
mTeSR™1 medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5850	Maintainence medium for H9 cells
PDMS	SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA	3097358-1004	Used for sticking the PDMS stencil and reservior
ROCKi Y27632	Calbiochem, Merck Millipore, Singapore	688000	Maintains H9 cells as single cells
STEMdiff™ APEL™ medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5210	Differentiation medium for H9 cells
Polyethylene terephthalate film	SureMark Singapore	SQ-6633	Used to form stencil
Cell culture compatible non-ionic surfactant	Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore	P2443	Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates