分化運命の空間組織を探るためのヒト多能性幹細胞のステンシルマイクロパターニング
Summary
ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は差別化した別個の組織パターンに自己組織化するための固有の能力を持っています。これは、空間的な環境勾配の提示を必要とするが。我々はHPSC分化パターンを制御するための生化学的および機械的な勾配を生成するためのシンプルかつ堅牢な方法としてステンシル微細を提示します。
Abstract
Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.
Introduction
胚性幹細胞（hESC）と人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含む、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は、広くすべての細胞系譜に、それらの分化能の正常および罹患器官の実験モデルならびに再生医療に利用されます三胚葉1,2。 hPSCsの分化運命は、物理的な手がかり3-5によって媒介される1と同様にメカノプロセスをシグナリングオートクリンまたはパラクリンを調節することができる地域の環境要因に対して非常に敏感です。セルの微細化は、空間的に、このような細胞-細胞相互作用6及び細胞-マトリックス相互作用を3として、局所的な細胞の微小環境を制御するための手段として、細胞集団の幾何学的形状と位置を整理するために開発された技術の集合を含みます。 hPSCsの文脈では、細胞は、微細ニッチ依存する方法に重要な洞察を得るために使用されていますENT自己分泌シグナル伝達は、初期胚の分化パターン6へのhESC多能性分化の決定7および組織を調節します。 2Dおよび3D微細hPSCsは、順番に3種の胚層8,9への分化決定に影響を与え、多パターンのコロニーの大きさを制御するために使用されています。我々は、インテグリンEカドヘリンクロストークは、細胞運命の異質10を生じさせることができるか調べるためにHPSCコロニー内の細胞-細胞および細胞-マトリックス相互作用の程度を調節するために多HPSCの微細パターンを採用しています。上記レポート発達疾患11のための薬物毒性スクリーニングのための実験モデルとしてhPSCsの多微細パターンの適用に向けたオープンな新しい道からデモンストレーション、組織または器官、開発中の成長因子およびホルモンの効果を研究するために、との形成を解明します組織パターン。
セルmicropatterの無数Falconnet らによって見直さとしてニング技術が開発されています。アル。12しかし、そのようなマイクロコンタクトは7,8,13印刷などのほんの一握りは、マイクロウェル文化14,15、光パターンは6とmicrostencils 16が正常に hPSCsで実装されています。微細hPSCsでのチャレンジは、その脆弱性と細胞の付着と生存のための特定の細胞外マトリックス（ECM）と成長条件の厳しい要件です。 2D HPSCパターンについて、マイクロコンタクト印刷は、組織培養、ガラス基板13上にHPSCの微細パターンを生成するための最も一般的な方法の一つです。方法は、マトリゲルなどラミニンおよび基底膜マトリックス、を含むHPSC文化、で使用されるパターンの共通ECMに使用することができます。しかし、それは、典型的には、ポリ-D-リジンにより支援二段階コーティングプロセスを必要とし、hPSCsは6,13に付着するための安定したECMの微細パターンを作製するために、特定の不活性大気の湿度条件を必要とします。各微細法の最も重要な考慮事項は、周辺地域への非特異的な細胞の付着を最小限に抑えながら、表面改質政権が希望の幾何学的な解像度でHPSC接着ECMパターンを生成することができるかどうかです。
ここでは、前に取り付けるためのhPSCs用接着ECMパターンの生成に追加の表面改質工程なしHPSCの微細パターンを生成するための簡単な方法として、ステンシル微細の使用を報告しています。細胞ステンシルは、スルーホール物理的にECMコーティングし、その後播種hPSCsを格納するための細胞培養基板上にシールサイズをミリメートルミクロンで、薄い膜、 例えば、ポリジメチルシロキサン（PDMS）シートで構成されています。ステンシルパターニングは物理的にHPSCにアクセスし、基礎となるECMコーティングされた基板に直接接続することができる場所を抑制することによって動作したように、この方法は、HPSC培養をサポートすることができる様々な基板と互換性があります。のみrequirementは、ステンシル材料の選択は、基板と可逆的シールを形成することができるということです。これらの基板は、従来の組織培養ポリスチレン（TCPS）17、リガンド共役基材18と同様に、調整可能な剛性を有するエラストマー材が挙げられる（ 例えば 、PDMS）19。この方法はまた、適切な取り付けとhPSCsの分化を可能にするために、このようなビトロネクチン（またはVTNタンパク質）、ラミニンおよび基底膜マトリックス（ 例えば 、マトリゲルとGeltrax）として異なるECMのコーティングを可能にします。したがって、我々は最適な細胞 – マトリックス接着、生存および分化のためのステンシル微細に特定のHPSCラインのための最適化されたECM-基板の構成を転送することができます。最近、同様の方法はまた、ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）マイクロステンシルアレイ16を使用してヒトES細胞を微細によって肝臓分化を導くことが報告されています。
細胞ステンシルが満たさ含む、異なる材料から製造することができますALS 20,21、ポリ（p-キシリレン）ポリマー22,23、PMMA 16、最も一般的には、PDMS 24-28。シリコン及びポリ（p-キシリレン）は、ステンシルは、貫通孔生物ユーザーへのアクセス可能性を制限する特殊な装置20-23との直接エッチングを必要とするポリマーです。 PDMSステンシルは、典型的には3ミクロンから2,000ミクロン11,26-29の範囲で必要な特徴の大きさに応じて異なる方法で製造することができます。小さ な特徴が所望される場合には、薄いステンシルシートは、微細パターン28のレリーフを含む微細加工シリコンテンプレート上にプレス成形PDMSプレポリマーによって製造することができます。機能>千μmのために、CO 2レーザーカッターは、直接ステンシル製作中プレキャストPDMSシート上のパターンをカットするための簡単かつ低コストの方法を提供します。 PDMSステンシルのリサイクルにも十分な一貫性のある一連の実験を実施するためにそれら費用対効果になります。
<p clお尻= "jove_content">ここでは、レーザー切断とのhESCの微細パターンの生成による千μmの機能を備えたPDMSステンシルを製造するための詳細な方法論を提示します。これらのhESCの微細パターンは、細胞接着の偏光は、細胞の運命異質10をもたらした方法空間を調査するために、凝集のhESCコロニー内のインテグリンの程度およびE-カドヘリン媒介性接着を調節するために使用しました。Protocol
Representative Results
Discussion
微細ステンシルの作製
ステンシル微細ニッチ媒介分化のパターニングを調査するためのHPSCの微細パターンを生成するための理想的な方法を提供します。このようなマイクロコンタクト印刷及び光パターンのような他の微細技術上のステンシルパターン形成の重要な利点は、それが表面改質を必要とせず、従来のTCPS基板上に実装することができること…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、付与（R-397-000-192-133）を起動し、ETPLギャップ・ファンド（R-397-000-198-592）NUSによってサポートされています。 GSはNUSの研究学者です。著者らは、細胞の微細化の彼女の技術サポートのために博士Jiangwa興に感謝したいと思います。
Materials
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 Cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 Cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
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