Stencil Micropatterning de las células madre pluripotentes para el sondeo Organización Espacial de la diferenciación Parcas

Summary

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen la capacidad intrínseca para diferenciarse y auto-organizarse en patrones de tejidos distintos; aunque esto requiere la presentación de los gradientes ambientales espaciales. Presentamos micropatterning plantilla como un método simple y robusto para generar gradientes bioquímicas y mecánicas para el control de los patrones de diferenciación HPSC.

Abstract

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Introduction

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs), incluyendo las células madre embrionarias (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), son ampliamente explotados en la medicina regenerativa, así como el modelado experimental de la organogénesis normal y enfermo debido a su potencial de diferenciación en linajes celulares de todos tres capas germinales ^1,2. El destino de diferenciación de hPSCs son muy sensibles a factores ambientales locales que pueden modular procesos mechanotransduction autocrinos o paracrinos de señalización ^1, así como mediadas por señales físicas ^3-5. Micropatterning célula abarca un conjunto de técnicas que se han desarrollado para organizar espacialmente la geometría y la localización de una población de células como un medio para controlar el microambiente celular local, tales como las interacciones célula-célula ⁶ y de las interacciones célula-matriz ^3. En el contexto de hPSCs, micropatterning celular se ha empleado para obtener una mejor aproximación a la forma depende de nichola señalización autocrina ent modula células madre decisiones pluripotencia de ^{diferenciación-7} y organización en los primeros patrones de diferenciación de embriones ^6. 2D y 3D hPSCs micropatterned se han utilizado para controlar el tamaño de las colonias de los patrones multicelulares, que a su vez influyeron en las decisiones de diferenciación en las tres capas germinales ^8,9. Hemos empleado micropatrones HPSC multicelulares para modular el grado de célula-célula y las interacciones célula-matriz en una colonia de HPSC para investigar cómo la diafonía integrina-E-cadherina puede dar lugar a la heterogeneidad del destino celular ^10. Las manifestaciones de los informes anteriores nuevas vías abiertas hacia la aplicación de micropatterns multicelulares de hPSCs como modelos experimentales para la detección de toxicidad de los medicamentos para enfermedades del desarrollo ^11, para estudiar el efecto de los factores de crecimiento y hormonas durante el tejido o el desarrollo de órganos, y para desentrañar la formación de los patrones de tejido.

Una miríada de micropatter celulartécnicas Ning se han desarrollado como revisado por Falconnet et. al., ¹² pero sólo un puñado, tales como micro-impresión de contacto ^{7,8,13, 14,15} cultura microplaca, photopatterning ⁶ y ¹⁶ microstencils se han aplicado con éxito con hPSCs. El reto con hPSCs micropatterning radica en su vulnerabilidad y un requisito estricto de matrices específicas extracelular (ECM) y condiciones de crecimiento para la fijación celular y la supervivencia. Para los patrones 2D HPSC, la impresión por microcontacto es uno de los métodos más comunes para generar micropatterns HPSC en cultivo de tejidos y de sustratos de vidrio ^13. El método se puede utilizar para patrón ECM común utilizado en la cultura HPSC, incluyendo laminina y la membrana basal, tales como matrices de Matrigel. Sin embargo, se requiere típicamente un procedimiento de revestimiento de dos etapas con la ayuda de poli-D-lisina, y necesita condiciones atmosféricas inertes y humedad específicas para hacer micropatrones ECM estables para hPSCs para fijar en ^6,13. La consideración más importante de cada método micropatterning es si el régimen de modificación de la superficie puede generar patrones de ECM HPSC-adhesivas en una resolución geométrica deseada al tiempo que minimiza la unión celular no específica a las zonas circundantes.

Aquí, se presenta el uso de la plantilla micropatterning como un método simple para generar micropatterns HPSC sin etapas adicionales de modificación de la superficie antes de la generación de patrones de ECM adhesivas para hPSCs para unir sucesivamente. La plantilla de célula comprende una membrana delgada, hoja por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS), con micras a milímetro tamaño orificios pasantes selladas sobre un sustrato de cultivo de células para contener físicamente recubrimientos ECM y hPSCs posteriormente sembradas. Como patrón de la plantilla funciona restringiendo físicamente el lugar donde HPSC puede acceder y conectar directamente al sustrato ECM subyacente recubierto, este método es compatible con varios sustratos que pueden apoyar las culturas HPSC. Los únicos requirement es que la elección del material de la plantilla puede formar un cierre reversible con el sustrato. Estos sustratos incluyen poliestireno convencional de cultivo de tejidos (TCPS) ^17, los sustratos conjugados de ligando ^18, así como sustratos elastoméricos con rigidez sintonizable (por ejemplo., PDMS) ^19. Este método también permite recubrimiento de diferentes ECM, tales como vitronectina (o proteína VTN), laminina y matrices de membrana basal (por ejemplo, Matrigel y Geltrax) para permitir la unión y la diferenciación de hPSCs adecuada. configuraciones ECM-sustrato, por lo tanto, podemos transferir optimizados para una línea específica para HPSC stencil Micropatterning para una óptima adhesión célula-matriz, la supervivencia y la diferenciación. Recientemente, también se ha informado de un método similar para dirigir la diferenciación hepática por hESCs Micropatterning utilizando poli (metacrilato de metilo) (PMMA) matrices de micro-stencil ^16.

stencils celulares pueden ser fabricados de diferentes materiales, incluyendo reunieronALS ^20,21, poli (p-xilileno) polímeros ^22,23, PMMA ¹⁶ y más comúnmente, PDMS ^24-28. El silicio y el poli (p-xilileno) polímeros plantillas requieren el grabado directo de los orificios pasantes con equipo especializado ^{20 a 23,} lo que limita su accesibilidad para los usuarios biológicos. PDMS plantillas pueden ser fabricados por diferentes métodos dependiendo del tamaño característica requerida, que varía típicamente de 3 micras a 2000 micras ^11,26-29. Si se desean características pequeñas, hojas de estarcir delgadas se pueden producir mediante moldeo por prensado PDMS pre-polímero en una plantilla de silicio microfabricado que contiene relieves de los micropatrones ^28. Para las funciones de> 1.000 micras, un cortador láser de CO ₂ proporciona un método fácil y de bajo costo para reducir directamente los patrones en una hoja de PDMS pre-fundido durante la fabricación de la plantilla. El reciclado de las plantillas de PDMS también los hace rentable para llevar a cabo una serie de experimentos con suficiente consistencia.

<p clculo = "jove_content"> A continuación, se presenta la metodología detallada para la fabricación de una plantilla de PDMS con 1.000 micras características mediante corte por láser y la generación de células madre micropatterns. Estos micropatrones de células madre se utilizan para modular la amplitud de la integrina y E-cadherina mediadas adherencias dentro de una colonia hESC cohesiva con el fin de investigar cómo polarización espacial de la adhesión celular resultó en la celda destino heterogeneidad ^10.

Protocol

NOTA: Este protocolo describe la fabricación de PDMS plantilla con 1.000 micras patrones de corte por láser y micropatterning de la línea de células madre, H9 usando la plantilla de PDMS. 1. Diseño y fabricación de PDMS de la plantilla para Micropatterning El diseño de la hoja de colocación de letreros de agujeros pasantes de la geometría y el tamaño deseados (por ejemplo, 1.000 micras círculos) y la junta de la plantilla utilizando el software de diseño asist…

Representative Results

En este trabajo se describe la fabricación de una plantilla de células mediante el uso de un cortador láser para generar 1.000 micras características. La plantilla se compone de 2 partes: una lámina delgada de letreros (aproximadamente 100-200 m de espesor) que contiene la microestructura agujeros pasantes, y una junta de PDMS para contener la solución de recubrimiento ECM o suspensión celular. Aquí, las hojas gruesas de PDMS comercialmente disponibles 127 micras y 2 mm se usaron…

Discussion

La fabricación de plantillas Micropatterning

micropatterning de la plantilla proporciona un método ideal para generar micropatterns HPSC para la investigación de nicho mediada por los patrones de diferenciación. La principal ventaja de los patrones de la plantilla sobre otras técnicas micropatterning, tales como impresión por microcontacto y photopatterning, es que no requiere modificación de la superficie y puede ser implementado sobre sustratos TCPS convenc…

Materials

2 mm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.005	Used to form reservoir for stencil
120-150 μm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.040	Used to form stencil
60 mm petri dish	Nunc Nunclon Delta	150326	Substrate for micropatterning
Accutase	Accutase, Merck Millipore, Singapore	SCR005	Enzyme to break H9 Cells into single cells
Activin	R&D Systems, Singapore	338-AC-010	Growth factor for H9 differentiation
BMP4	R&D Systems, Singapore	338-BP-010	Growth factor for H9 differentiation
Plasma system	Femto Science, Korea	CUTE-MP	For plasma oxidation of stencil
Dispase	StemCell™ Technologies, Singapore	7923	Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12	GIBCO, USA	11330032	Basal medium for H9 cells
FGF2	R&D Systems, Singapore	233–FB–025	Growth factor for H9 differentiation
H9 Cell line	WiCell Research Institute, Inc., USA	WA09	Human embryonic stem cells
hESC-qualified basement membrane matrix	Matrigel, BD Biosciences, Singapore	354277	Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells
Inverted microscope	Leica Microsystems, Singapore	DMi1	For capturing bright-field images
Laser cutter	Epilog Helix 24 Laser System		Used to generate through holes in PDMS sheet
mTeSR™1 medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5850	Maintainence medium for H9 cells
PDMS	SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA	3097358-1004	Used for sticking the PDMS stencil and reservior
ROCKi Y27632	Calbiochem, Merck Millipore, Singapore	688000	Maintains H9 cells as single cells
STEMdiff™ APEL™ medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5210	Differentiation medium for H9 cells
Polyethylene terephthalate film	SureMark Singapore	SQ-6633	Used to form stencil
Cell culture compatible non-ionic surfactant	Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore	P2443	Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates