الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لديهم القدرة الذاتية للتمييز وتنظيم الذات في أنماط النسيج متميزة. على الرغم من أن هذا يتطلب عرض التدرجات البيئية المكانية. نقدم الاستنسل micropatterning كوسيلة من وسائل بسيطة وقوية لتوليد التدرجات الكيميائية الحيوية والميكانيكية للسيطرة على أنماط التمايز hPSC.
Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.
الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (hESCs) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs)، وتستغل على نطاق واسع في الطب التجديدي، وكذلك نماذج تجريبية من توالد الطبيعي والمريضة بسبب إمكانية المفاضلة الخاصة بهم في الأنساب خلية من كل ثلاث طبقات جرثومية 1،2. مصير التفريق بين hPSCs شديدة الحساسية للعوامل البيئية المحلية التي يمكن أن تعدل عمليات mechanotransduction autocrine أو نظير الصماوي يشير 1 وكذلك بوساطة الإشارات الجسدية 3-5. يشمل micropatterning خلية مجموعة من التقنيات التي تم تطويرها لتنظيم مكانيا هندسة والمكان من السكان خلية كوسيلة للسيطرة على المكروية الخلوية المحلية، مثل التفاعلات خلية خلية 6 والتفاعلات خلية مصفوفة 3. في سياق hPSCs، واستخدمت micropatterning خلية للحصول على أفكار هامة في كيفية محراب تعتمدوالأنف والحنجرة إشارات autocrine ينظم HESC القرارات تعدد القدرات تمايز 7 والتنظيم في وقت مبكر أنماط التمايز الجنينية 6. وقد استخدمت 2D و 3D hPSCs micropatterned للتحكم في حجم مستعمرة من أنماط متعددة الخلايا، والتي بدورها أثرت على قرارات التمايز في الطبقات الجرثومية الثلاث 8،9. لقد استخدمنا micropatterns hPSC متعددة الخلايا لتعديل حجم خلية خلية والتفاعلات خلية مصفوفة داخل مستعمرة hPSC لمعرفة كيف يمكن للإنتغرين-E-كادهيرين الحديث المتبادل يمكن أن تؤدي إلى مصير خلية التجانس 10. المظاهرات من التقارير المذكورة تفتح مجالات جديدة نحو تطبيق micropatterns متعددة الخلايا من hPSCs كنماذج تجريبية لفحص سمية الدواء للأمراض التنموية 11، لدراسة تأثير عوامل النمو والهرمونات خلال الأنسجة أو تطوير الجهاز، ولكشف تشكيل أنماط النسيج.
عدد لا يحصى من micropatter خليةوقد تم تطوير تقنيات نينغ على النحو الذي استعرضه Falconnet وآخرون. آل 12 ولكن فقط حفنة، مثل الصغرى الاتصال الطباعة 7،8،13، ثقافة microwell 14،15، photopatterning تم تنفيذ 6 وmicrostencils 16 بنجاح مع hPSCs. التحدي مع hPSCs micropatterning يكمن في ضعفها والمتطلبات الصارمة للمصفوفات معينة خارج الخلية (ECM) وظروف النمو لمرفق الخلية والبقاء على قيد الحياة. لأنماط 2D hPSC والطباعة الاتصال الصغرى هي واحدة من أكثر الطرق شيوعا لتوليد micropatterns hPSC على زراعة الأنسجة والزجاج ركائز 13. ويمكن استخدام هذه الطريقة لECM المشترك نمط المستخدمة في الثقافة hPSC، بما في ذلك laminin والغشاء القاعدي المصفوفات، مثل Matrigel. ومع ذلك، فإنه عادة ما يتطلب عملية طلاء خطوتين بمساعدة بولي-D-ليسين، ويحتاج الظروف الجوية والرطوبة الخاملة محددة لجعل micropatterns ECM مستقر لhPSCs لنعلق على 6،13. النظر قبل كل شيء من كل طريقة micropatterning هو ما إذا كان نظام تعديل السطح يمكن أن تولد أنماط ECM hPSC لاصقة في القرار الهندسي المطلوب، مع التقليل من مرفق الخلية غير محددة إلى المناطق المحيطة بها.
هنا، ونحن التقرير استخدام micropatterning الاستنسل كوسيلة من وسائل بسيطة لتوليد micropatterns hPSC دون خطوات تعديل سطح إضافية قبل جيل من أنماط ECM لاصقة لhPSCs إرفاق جرا. ويضم الاستنسل الخلية من غشاء رقيق، ورقة على سبيل المثال، ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS)، مع ميكرون إلى ملليمتر حجم من خلال ثقوب مختومة على ركيزة الثقافة الخلية لاحتواء جسديا الطلاءات ECM وhPSCs المصنف في وقت لاحق. كما تعمل الاستنسل الزخرفة بإعاقة جسدية الموقع حيث يمكن hPSC الوصول وإرفاق مباشرة إلى الركيزة ECM الأساسي المغلفة، وهذا الأسلوب هو متوافق مع مختلف ركائز التي يمكن أن تدعم الثقافات hPSC. والاحتياج فقطتي هو أن اختيار المواد الاستنسل يمكن ان تشكل ختم عكسها مع الركيزة. وتشمل هذه الركائز التقليدية البوليسترين زراعة الأنسجة (برنامج التعاون الفني) 17، ركائز مترافق يجند 18، وكذلك ركائز المرنة مع صلابة الانضباطي (على سبيل المثال، PDMS) 19. كما يسمح هذا الأسلوب طلاء ECM مختلفة، مثل vitronectin (أو البروتين VTN)، laminin والمصفوفات الغشاء القاعدي (على سبيل المثال، Matrigel وGeltrax) للسماح لمرفق السليم والتفريق بين hPSCs. ولذلك، فإننا يمكن نقل الأمثل تكوينات ECM-الركيزة للحصول على خط hPSC محددة لالاستنسل micropatterning الأمثل لخلية مصفوفة التصاق والبقاء والتمايز. في الآونة الأخيرة، كما تم الإبلاغ عن طريقة مماثلة لتوجيه التمايز كبدي من hESCs micropatterning باستخدام بولي (ميتاكريليت الميثيل) (PMMA) صفائف الاستنسل الدقيقة 16.
الإستنسل خلية يمكن أن تكون ملفقة من مواد مختلفة، بما في ذلك التقى المرض 20،21، بولي (ف xylylene) البوليمرات 22،23، PMMA 16 و الأكثر شيوعا، PDMS 24-28. السيليكون وبولي (ف xylylene) البوليمرات الإستنسل تتطلب الحفر المباشر للمن خلال ثقوب مع المعدات المتخصصة 20-23، الأمر الذي يحد من إمكانية الوصول إليها للمستخدمين البيولوجي. PDMS الإستنسل يمكن أن تكون ملفقة من قبل وسائل مختلفة اعتمادا على حجم الميزة المطلوبة، والتي تتراوح عادة من 3 ميكرون إلى 2000 ميكرومتر 11،26-29. وإذا رغبت الميزات الصغيرة، وصحائف بالستينسيل رقيقة يمكن أن تنتج من قبل الصحافة صب PDMS قبل البوليمر على قالب السيليكون microfabricated تحتوي على نقوش من micropatterns 28. لميزات> 1000 ميكرون، ويوفر قاطع ليزر CO 2 وسيلة سهلة ومنخفضة التكاليف لخفض مباشرة أنماط على ورقة PDMS محمل مسبقا خلال تلفيق الاستنسل. وإعادة التدوير من الإستنسل PDMS أيضا يجعلها فعالة من حيث التكلفة لإجراء سلسلة من التجارب بما يكفي من الاتساق.
<p clالحمار = "jove_content"> هنا، نقدم منهجية مفصلة لصنع الاستنسل PDMS مع 1000 ميكرون الميزات بواسطة القطع بالليزر وتوليد micropatterns HESC. واستخدمت هذه micropatterns HESC لتعديل مدى إنتغرين وE-كادهيرين بوساطة التصاقات داخل مستعمرة HESC متماسكة وذلك لمعرفة كيف أدى الاستقطاب المكاني للالتصاق الخلايا في خلية مصير التجانس 10.تصنيع الإستنسل micropatterning
يوفر micropatterning الاستنسل الأسلوب الأمثل لتوليد micropatterns hPSC للتحقيق بوساطة المتخصصة التمايز الزخرفة. إن الميزة الأساسية لتنميط الاستنسل على تقنيات micropatterning أخرى، مثل microcontact الطباعة وphotopatterning، ?…
The authors have nothing to disclose.
ويدعم هذا العمل من قبل جامعة سنغافورة الوطنية بدء التشغيل منحة (R-397-000-192-133) وصندوق الفجوة ETPL (R-397-000-198-592). ع هو عالم أبحاث جامعة سنغافورة الوطنية. سيكون الكتاب أود أن أشكر الدكتور Jiangwa شينغ لها الدعم الفني على micropatterning الخلية.
2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
60 mm petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 Cells into single cells |
Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
H9 Cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |