भेदभाव भाग्य के स्थानिक संगठन जांच के लिए मानव स्टेम कोशिकाओं के स्टैंसिल micropatterning
Summary
मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) को अलग करने के लिए और विशिष्ट ऊतक पैटर्न में स्वयं को व्यवस्थित आंतरिक क्षमता है; हालांकि इस स्थानिक पर्यावरण ढ़ाल की प्रस्तुति की आवश्यकता है। हम hPSC भेदभाव पैटर्न को नियंत्रित करने के लिए जैव रासायनिक और यांत्रिक ढ़ाल उत्पन्न करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि के रूप में स्टैंसिल micropatterning प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.
Introduction
मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs), भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) सहित व्यापक रूप से पुनर्योजी चिकित्सा में के रूप में अच्छी तरह से सामान्य और रोगग्रस्त जीवोत्पत्ति की प्रयोगात्मक मॉडलिंग के रूप में उनके भेदभाव की क्षमता की वजह से सभी की सेल प्रजातियों में शोषण कर रहे हैं तीन रोगाणु परतों 1,2। HPSCs के भेदभाव भाग्य अत्यधिक स्थानीय पर्यावरणीय कारकों है कि ऑटोक्राइन या पैराक्राइन 1 संकेत के साथ ही mechanotransduction प्रक्रियाओं शारीरिक संकेतों 3-5 से मध्यस्थता कर सकते हैं मिलाना के प्रति संवेदनशील हैं। सेल micropatterning तकनीक है कि इस तरह के स्थानिक सेल सेल बातचीत 6 और सेल मैट्रिक्स बातचीत 3 के रूप में, स्थानीय सेलुलर microenvironment नियंत्रित करने के लिए एक मतलब के रूप में ज्यामिति और एक सेल की आबादी के स्थान व्यवस्थित करने के लिए विकसित किया गया है का एक सेट शामिल हैं। hPSCs के संदर्भ में, सेल micropatterning कैसे आला-निर्भर में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए नियोजित किया गया हैईएनटी ऑटोक्राइन सिगनल जल्दी भ्रूण भेदभाव पैटर्न 6 में hESC pluripotency-भेदभाव फैसलों 7 और संगठन modulates। 2 डी और 3 डी micropatterned hPSCs बहुकोशिकीय पैटर्न, जो बारी में तीन रोगाणु परतों 8,9 में भेदभाव निर्णयों को प्रभावित की कॉलोनी आकार को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम एक hPSC कॉलोनी के भीतर सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत की हद मिलाना की जांच के लिए कैसे इंटीग्रिन-ई cadherin crosstalk सेल भाग्य विविधता 10 को जन्म दे सकते हैं बहुकोशिकीय hPSC micropatterns कार्यरत है। विकास रोगों 11, ऊतक या अंग विकास के दौरान वृद्धि कारक है और हार्मोन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए दवा विषाक्तता स्क्रीनिंग के लिए प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में hPSCs की बहुकोशिकीय micropatterns के आवेदन की दिशा ऊपर की रिपोर्ट के खुले नए रास्ते से प्रदर्शनों, और के गठन को जानने के लिए ऊतक पैटर्न।
सेल micropatter के असंख्यनिंग तकनीक के रूप में Falconnet एट द्वारा समीक्षा विकसित किया गया है। अल। 12 लेकिन इस तरह के सूक्ष्म संपर्क मुद्रण 7,8,13 के रूप में केवल एक मुट्ठी, microwell संस्कृति 14,15, photopatterning 6 और microstencils 16 सफलतापूर्वक hPSCs के साथ लागू किया गया है। micropatterning hPSCs के साथ चुनौती अपने जोखिम और सेल लगाव और अस्तित्व के लिए विशिष्ट कोशिकी matrices (ईसीएम) और विकास की स्थिति की एक कड़े आवश्यकता में निहित है। 2 डी hPSC पैटर्न के लिए, सूक्ष्म संपर्क मुद्रण सबसे आम तरीकों में टिशू कल्चर और ग्लास substrates 13 पर hPSC micropatterns उत्पन्न करने के लिए में से एक है। विधि पैटर्न आम ऐसे Matrigel के रूप में laminin और तहखाने झिल्ली matrices, सहित hPSC संस्कृति में इस्तेमाल किया ईसीएम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह आम तौर पर एक दो कदम कोटिंग प्रक्रिया पाली-D-लाइसिन द्वारा सहायता प्राप्त की आवश्यकता है, और विशिष्ट अक्रिय वायुमंडलीय और आर्द्रता की स्थिति की जरूरत स्थिर ईसीएम micropatterns बनाने के लिए hPSCs 6,13 पर संलग्न करने के लिए। प्रत्येक micropatterning विधि के अग्रणी विचार सतह संशोधन शासन वांछित ज्यामितीय संकल्प पर hPSC चिपकने वाला ईसीएम पैटर्न उत्पन्न जबकि आसपास के क्षेत्रों के लिए unspecific सेल लगाव को कम कर सकते हैं कि क्या है।
यहाँ, हम एक सरल विधि के रूप में स्टैंसिल micropatterning के उपयोग की रिपोर्ट hPSCs पर संलग्न करने के लिए अतिरिक्त कदम सतह संशोधन चिपकने वाला ईसीएम पैटर्न की पीढ़ी के लिए पहले बिना hPSC micropatterns उत्पन्न करते हैं। सेल स्टैंसिल के माध्यम से छेद एक सेल संस्कृति सब्सट्रेट शारीरिक रूप से ईसीएम कोटिंग्स और बाद में वरीयता प्राप्त hPSCs को रोकने के लिए पर सील आकार मिलीमीटर, एक पतली झिल्ली, जैसे, polydimethylsiloxane (PDMS) शीट के शामिल हैं माइक्रोन के साथ। स्टैंसिल patterning शारीरिक रूप से स्थान जहां hPSC अंतर्निहित ईसीएम लेपित सब्सट्रेट करने के लिए उपयोग और संलग्न कर सकते हैं सीधे निरोधक द्वारा काम करता है, इस विधि विभिन्न substrates कि hPSC संस्कृतियों का समर्थन कर सकते हैं के साथ संगत है। केवल requiremenटी कि स्टैंसिल सामग्री का चुनाव सब्सट्रेट के साथ एक प्रतिवर्ती मुहर फार्म कर सकते है। इन substrates पारंपरिक टिशू कल्चर polystyrene (TCPS) 17, ligand संयुग्मित substrates 18, साथ ही ट्यून करने योग्य कठोरता के साथ elastomeric substrates शामिल हैं (उदाहरण के लिए।, PDMS) 19। इस विधि को भी अलग ईसीएम की कोटिंग, ऐसे vitronectin (या VTN प्रोटीन), laminin और तहखाने झिल्ली matrices (जैसे, Matrigel और Geltrax) के रूप में उचित लगाव और hPSCs के भेदभाव के लिए अनुमति देने के लिए अनुमति देता है। एक विशिष्ट hPSC लाइन के लिए इसलिए, हम अनुकूलित हस्तांतरण कर सकते हैं ईसीएम सब्सट्रेट विन्यास इष्टतम सेल मैट्रिक्स आसंजन, अस्तित्व और भेदभाव के लिए micropatterning स्टैंसिल करने के लिए। हाल ही में, एक समान विधि भी पाली (मिथाइल methacrylate) का उपयोग micropatterning hESCs (PMMA) सूक्ष्म स्टैंसिल सरणियों 16 से यकृत भेदभाव को निर्देशित करने के लिए सूचित कर दिया गया है।
सेल स्टेंसिल, विभिन्न सामग्रियों से गढ़े जा सकता मुलाकात सहितए एल एस 20,21, पाली (पी-xylylene) पॉलिमर 22,23, PMMA 16 और सबसे अधिक, PDMS 24-28। सिलिकॉन और पाली (पी-xylylene) पॉलिमर स्टेंसिल विशेष उपकरणों 20-23, जो जैविक उपयोगकर्ताओं के लिए उनकी पहुंच को सीमित करता है के साथ के माध्यम से छेद के प्रत्यक्ष नक़्क़ाशी की आवश्यकता होती है। PDMS स्टेंसिल सुविधा आकार की आवश्यकता है, जो आमतौर पर 3 माइक्रोन के लिए 2,000 माइक्रोन 11,26-29 से पर्वतमाला के आधार पर अलग अलग तरीकों से गढ़े जा सकता है। छोटे सुविधाओं वांछित हैं, पतली शीट stenciling प्रेस मोल्डिंग PDMS micropatterns 28 की राहतें युक्त एक microfabricated सिलिकॉन टेम्पलेट पर पूर्व बहुलक द्वारा उत्पादित किया जा सकता है। विशेषताएं> 1,000 माइक्रोन के लिए, एक सीओ 2 लेजर कटर एक आसान और कम लागत विधि सीधे स्टैंसिल निर्माण के दौरान एक पूर्व casted PDMS शीट पर पैटर्न में कटौती करने के लिए प्रदान करता है। PDMS स्टेंसिल की recyclability भी पर्याप्त स्थिरता के साथ प्रयोगों की एक श्रृंखला का संचालन करने के लिए उन्हें लागत प्रभावी बनाता है।
<p clगधा = "jove_content"> यहाँ, हम विस्तृत कार्यप्रणाली लेजर काटने से 1,000 माइक्रोन सुविधाओं के साथ एक PDMS स्टैंसिल के निर्माण और hESC micropatterns की पीढ़ी के लिए उपस्थित थे। ये hESC micropatterns इंटीग्रिन की हद तक व्यवस्थित करना इस्तेमाल किया गया और ई cadherin मध्यस्थता एक जोड़नेवाला hESC कॉलोनी के भीतर adhesions के रूप में तो जांच करने के लिए कैसे कोशिका आसंजन के स्थानिक ध्रुवीकरण सेल भाग्य विविधता 10 में हुई।Protocol
Representative Results
Discussion
Micropatterning स्टेंसिल का निर्माण
स्टैंसिल micropatterning आला मध्यस्थता भेदभाव patterning की जांच के लिए hPSC micropatterns उत्पन्न करने के लिए एक आदर्श तरीका प्रदान करता है। ऐसे microcontact मुद्रण और photopatterning के रूप में अन्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनयूएस के द्वारा समर्थित है अनुदान शुरू (आर-397-000-192-133) और ETPL गैप फंड (आर-397-000-198-592)। जीएस एक एनयूएस रिसर्च स्कॉलर है। लेखक सेल micropatterning पर उसे तकनीकी सहायता के लिए डॉ Jiangwa जिंग को धन्यवाद देना चाहूंगा।
Materials
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 Cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 Cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
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