Stencil Micropatterning av mänskliga pluripotenta stamceller för undersökning fysisk planering av differentiering Fates
Summary
Humana pluripotenta stamceller (hPSCs) har den inneboende förmågan att differentiera och själv organisera sig i olika vävnadsmönster; men detta kräver presentation av rumsliga miljö gradienter. Vi presenterar stencil micropatterning som en enkel och robust metod för att generera biokemiska och mekaniska gradienter för styrning hPSC differentieringsmönster.
Abstract
Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.
Introduction
Humana pluripotenta stamceller (hPSCs), inklusive embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), allmänt utnyttjas i regenerativ medicin samt experimentell modellering av normal och sjuk organogenesen på grund av deras differentiering potential till cellinjer av alla tre germinallager 1,2. Differentieringen öden hPSCs är mycket känsliga för lokala miljöfaktorer som kan modulera autokrina eller parakrina signalerar pt liksom mechanotransduction processer förmedlade genom fysiska signaler 3-5. Cell micropatterning omfattar en uppsättning tekniker som har utvecklats för att spatialt organisera geometri och placering av en cellpopulation som ett sätt att styra den lokala cellulära mikro, såsom cell-cell-interaktioner 6 och cell-matrix interaktioner 3. I samband med hPSCs har cell micropatterning använts för att få betydande insikt i hur nisch-beroendeENT autokrin signalering modulerar hESC pluripotens-differentiering beslut 7 och organisation i början av embryonala differentieringsmönster 6. 2D och 3D micropatterned hPSCs har använts för att reglera kolonistorleken av flercelliga mönster, vilket i sin tur påverkade differentierings besluten i de tre groddblad 8,9. Vi har använt flercelliga hPSC micropatterns att modulera omfattningen av cell-cell och cell-matris-interaktioner inom en hPSC koloni för att sondera hur grin-E-cadherin överhörning kan ge upphov till cell öde heterogenitet 10. Demonstrationerna från ovanstående rapporter öppna nya vägar mot tillämpningen av flercelliga micropatterns av hPSCs som experimentella modeller för läkemedelstoxicitet screening för utvecklings sjukdomar 11, för att studera effekten av tillväxtfaktorer och hormoner under vävnad eller organutveckling, och att riva upp bildandet av vävnadsmönster.
En myriad av cell micropatterning tekniker har utvecklats som granskats av FALCONNET et. al. 12, men bara en handfull, såsom mikro-kontakt utskrift 7,8,13, mikro kultur 14,15, photopatterning 6 och microstencils 16 har framgångsrikt genomförts med hPSCs. Utmaningen med micropatterning hPSCs ligger i deras sårbarhet och en stringent krav på specifika extracellulära matriser (ECM) och tillväxtbetingelser för cellbindning och överlevnad. För 2D hPSC mönster, är mikrokontakttryckning en av de vanligaste metoderna för att generera hPSC micropatterns på vävnadsodlings och glassubstrat 13. Metoden kan användas för att mönstra gemensamma ECM används i hPSC kultur, inklusive laminin och basalmembranmatriserna, såsom Matrigel. Det kräver dock vanligen en tvåstegs beläggningsprocessen med hjälp av Poly-D-lysin, och kräver särskilda inerta atmosfäriska och fuktighet för att göra stabila ECM micropatterns för hPSCs att fästa på 6,13. Den främsta hänsyn till varje micropatterning metod är att ordningen ytmodifieringen kan generera hPSC självhäftande ECM mönster på önskad geometrisk upplösning och samtidigt minimera ospecifik cellbindning till de omgivande områdena.
Här rapporterar vi användning av stencil micropatterning som en enkel metod för att generera hPSC micropatterns utan ytterligare yta modifieringssteg före genereringen av bindemedels ECM mönster för hPSCs att fästa på. Cell stencil består av ett tunt membran, t ex polydimetylsiloxan (PDMS) ark, med mikron till millimeterstorlek genomgående hål förseglade på en cellodlingssubstrat för att fysiskt innehålla ECM beläggningar och därefter seedade hPSCs. Som stencil mönstring fungerar genom att fysiskt hålla tillbaka den plats där hPSC kan komma åt och fästa direkt på det underliggande ECM belagda substratet, är denna metod är kompatibel med olika substrat som kan stödja hPSC kulturer. De enda requirement är att valet av stencilen material kan bilda en reversibel tätning med substratet. Dessa substrat innefattar konventionella vävnadskulturpolystyren (TCPS) 17, ligand konjugerade substraten 18, såväl som elastomera substrat med avstämbar styvhet (t ex., PDMS) 19. Denna metod tillåter också beläggning av olika ECM, såsom vitronektin (eller VTN protein), laminin och basalmembran matriser (t.ex. Matrigel och Geltrax) för att möjliggöra ordentlig fastsättning och differentiering av hPSCs. Därför kan vi överföra optimerade ECM-substrat konfigurationer för en viss hPSC linje att stencil micropatterning för optimal cellmatris vidhäftning, överlevnad och differentiering. Nyligen har en liknande metod även rapporterats att rikta lever differentiering av micropatterning hESCs användning av poly (metylmetakrylat) (PMMA) mikro stencil arrayer 16.
Cell schabloner kan tillverkas av olika material, inklusive uppfylldaals 20,21, poly (p-xylylen) polymerer 22,23, PMMA 16 och vanligast, PDMS 24-28. Kisel och poly (p-xylylen) polymerer stenciler kräver direkt etsning av de genomgående hålen med specialutrustning 20-23, vilket begränsar deras tillgänglighet till biologiska användare. PDMS stenciler kan framställas genom olika metoder beroende på funktionen storlek som krävs, som vanligtvis sträcker sig från 3 pm till 2000 pm 11,26-29. Om små funktioner önskas, kan tunna stenciling ark framställas genom formpressning PDMS pre-polymer på en mikrofabricerad kisel mall innehållande reliefer av de micropatterns 28. För funktioner> 1000 fim, ger en CO 2 laserskärare en enkel och billig metod för att direkt skära mönster på en i förväg gjuten PDMS arket under stencil tillverkning. Återvinning av PDMS stenciler gör dem också kostnadseffektivt att genomföra en serie experiment med tillräcklig konsistens.
<p class = "jove_content"> Här presenterar vi en detaljerad metod för tillverkning av en PDMS stencil med 1000 pm funktioner genom laserskärning och generering av hESC micropatterns. Dessa hESC micropatterns användes för att modulera graden av integrin och E-cadherin medierad adhesioner inom en kohesiv hESC koloni för att undersöka hur spatial polarisering av celladhesion resulterade i cell öde heterogenitet 10.Protocol
Representative Results
Discussion
Tillverkning av micropatterning stenciler
Stencil micropatterning ger en idealisk metod för att generera hPSC micropatterns för att undersöka nisch-medierad differentiering mönstring. Den viktigaste fördelen med stencil mönstring över andra micropatterning tekniker, såsom mikrokontakttryckning och photopatterning, är att den inte kräver ytmodifiering och kan genomföras på konventionella TCPS substrat. Därför kan optimerade odlingsmedier och ECM belägg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NUS startbidrag (R-397-000-192-133) och ETPL Gap Fund (R-397-000-198-592). GS är en NUS forskaren. Författarna vill tacka Dr Jiangwa Xing för hennes teknisk support på cell micropatterning.
Materials
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 Cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 Cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
Referências
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50, 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
