إعداد المستعمرات وحيد الفوج وهرمون علاج نحل العسل عامل لتحليل علم وظائف الأعضاء المصاحبة لدور و / أو نظام الغدد الصماء
Summary
نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا لإعداد طوائف نحل العسل-فوج واحدة – أداة مفيدة لتحليل علم وظائف الأعضاء العامل المرتبط الدور. وصفنا أيضا بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لعلاج العاملين مع هرمون الشباب وإكديسون لتقييم مشاركة هذه الهرمونات في تنظيم السلوك عامل و / أو علم وظائف الأعضاء.
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
نحل العسل الأوروبي، mellifera أبيس، هو حشرة eusocial مع مجتمع منظم للغاية 1. ويشارك نحل العسل عامل (الطبقة العاملة) في المهام المختلفة للحفاظ على النشاط مستعمرة، وتغيير هذه المهام وفقا لعمر النحل العامل بعد eclosion، والتي يشار اليها على انها تقسيم المرتبطة بالعمر العمل 2-4. العمال الشباب (<13 يوما) رعاية الحضنة في الخلية عن طريق إفراز غذاء ملكات النحل (النحل ممرضة)، في حين أن العمال كبار السن (> 15 يوما من العمر) جمع الرحيق وحبوب اللقاح خارج الخلية (علافات) 2-4. علم وظائف الأعضاء من العمال يتغير بالاشتراك مع هذا التحول الدور. على سبيل المثال، وظيفة الغدد البلعوم السفلي (HPGs)، إقران الغدد خارجية الإفراز تقع في الرأس، والتغيرات بالتعاون مع تحول الدور من التمريض لتستخدم علفا 2،5. HPGs ممرضة النحل أساسا توليف البروتين غذاء ملكات النحل الكبرى، والتي هي المكونات الرئيسية للحليب النحل. من ناحية أخرى، HPGs المؤن بشكل رئيسيتركيب إنزيمات استقلاب الكربوهيدرات، مثل α جلوكوزيد الثالث، لمعالجة الرحيق إلى عسل عن طريق تحويل السكروز إلى جلوكوز وفركتوز. كشفت دراساتنا السابقة أن التعبير عن mrjp2، الذي يشفر بروتين غذاء ملكات النحل كبير، وHbg3، الذي يشفر الفا جلوكوزيد الثالث، والتغيرات خلال تحويل دور 6-9.
لتحديد ما إذا كانت التغيرات الفسيولوجية في الأنسجة عامل، بما في ذلك HPGs، ويرتبط مع تحول دور أو مع سن العمال، سيكون من المفيد لمعالجة التركيبة السكانية من مستعمرة نحل العسل، مثل لإعداد وحيدة الفوج المستعمرات التي عمال تقريبا نفس الفئة العمرية تنفيذ مهام مختلفة 10،11. روبنسون وآخرون (1989) ووصف طريقة لإقامة مستعمرة نموذجية واحدة (10). وتضم المستعمرات واحد-فوج البداية ملكة والعمال القديم 0-2 يوم. بعد عدة أيام من إقامة المستعمرات، عمال ALMمعاهدة الفضاء الخارجي في نفس العمر تولي مهام مختلفة. بعض العمال على أداء مهام التمريض كما هو الحال في مستعمرات نموذجية، في حين أن غيرهم من العمال أداء المهام تستخدم علفا للوقت أبكر من المعتاد، وبالتالي فهي تسمى علافات قبل الاوان. سوف مقارنات التعبير الجيني بين النحل ممرضة وعلافات قبل الاوان توفير معلومات مفيدة عن علم وظائف الأعضاء المرتبط دور الأنسجة عامل 12-16. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لإعداد المستعمرات فوج واحدة لتحليل علم وظائف الأعضاء role- و / أو المرتبط بالعمر من HPGs 16. نحن أيضا وصف موجز كيفية فحص التعبير الجيني من mrjp2 وHbg3 التي كتبها الكمي العكسي سلسلة من ردود الفعل النسخ-البلمرة (RT-PCR) لتقييم HPG علم وظائف الأعضاء.
بالإضافة إلى تحليل علم وظائف الأعضاء العاملين في المستعمرات فوج واحد، النظر في نظام الغدد الصماء مهم لتحليل الآليات التنظيمية المرتبطة دور علم وظائف الأعضاء عامل. هرمون الشباب (JH)، الذي كنوسفل مثل هرمون "الوضع الراهن" في يرقات الحشرات، ويسرع التحول في الدور من التمريض إلى البحث عن الطعام في نحل العسل عامل 11. وعلاوة على ذلك، إكديسون، والذي يعرف باسم هرمون طرح الريش أثناء التحول، قد يكون متورطا في تحويل دور للجينات التي ترميز إكديسون يشير الجزيئات التي أعرب عنها في الهيئات الفطر، مركزا أعلى من الدماغ عامل 17-19. ولذلك، فإننا أيضا وصف بروتوكول مفصلة تستخدم في دراستنا السابقة 16 لعلاج العاملين مع 20E، وهو شكل نشط من إكديسون، والميثوبرين، والتماثلية JH، لتحليل تأثير نظام الغدد الصماء في HPG علم وظائف الأعضاء (التعبير عن mrjp2 وHbg3).
Protocol
Representative Results
Discussion
إعداد المستعمرات فوج واحدة
نحن هنا وصف البروتوكول المستخدم في دراستنا السابقة 16 إلى إعداد المستعمرات فوج واحدة لتحليل HPG علم وظائف الأعضاء المرتبطة التحول في دور الشغالات. وقد لوحظت النحل ممرضة وعلافات قبل الاوان أن استوف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. . The insect societies. , (1971).
- Winston, M. L. . The biology of the honey bee. , (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN–description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
