Tek kohort Kolonileri ve İşçi arıların Hormon Tedavisi hazırlanması Rolü ve / veya Endokrin Sistemi Fizyolojisi İlişkili Analiz
Summary
Burada tek kohort bal arısı kolonilerinin hazırlanması için detaylı protokol açıklar – rol ilişkili işçi fizyolojisi analiz etmek için kullanışlı bir araç. Biz de işçi davranışı ve / veya fizyoloji düzenlenmesinde bu hormonların katılımını değerlendirmek jüvenil hormon ve ekdisonla işçileri tedavisi için ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
Avrupa bal arısı, Apis mellifera, son derece örgütlü bir toplumda 1 ile eusocial böcek olduğunu. İşçi bal arıları (emek kast) koloni etkinliğini sürdürmek için çeşitli görevler yapan ve bu görevleri emek 2-4 yaşa bağlı bölümü olarak adlandırılır eclosion sonra işçi bal arısı yaşına göre değişir. Genç işçiler (<13 gün) yaşlı işçiler ise, arı sütü (hemşire arılar) salgılayarak kovandaki yavru özen (> 15 gün) kovanı (silaj) 2-4 dışındaki nektar ve polen toplamak. İşçilerin fizyolojisi bu rol kayması ile birlikte değişir. Örneğin, hipofaringeal bezleri (HPGler) işlevi, 2,5 kazarak için hemşirelik rol kayması ile birlikte egzokrin kafasında bulunan bezleri, değişiklikleri eşleştirilmiş. Hemşire arı HPGler ağırlıklı arı sütünün en önemli bileşenleri olan büyük arı sütü proteinleri sentezler. Öte yandan, toplayıcı HPGler ağırlıklıglukoz ve fruktoz halinde sakaroz dönüştürerek bal içine nektar işlemek için, bu tür α-glukosidaz III olarak karbonhidrat metabolize edici enzimleri, sentez. Daha önceki çalışmalar ortaya koydu rolü kayması 6-9 içinde α-glukozidaz III değişiklikleri kodlayan önemli bir arı sütü protein ve Hbg3 kodlayan mrjp2 ekspresyonu.
HPGler dahil işçi dokularda fizyolojik değişiklikler, rol kayması veya işçilerin yaş ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için, tek kohort hazırlamak için gibi, bir arı kolonisinin nüfusu kompozisyonunu işlemek için yararlı olacaktır koloniler hangi neredeyse aynı yaştaki işçiler farklı görevleri 10,11 gerçekleştirin. Robinson ve ark. (1989), tek bir kohort koloni 10 oluşturulması için bir yöntem açıklamıştır. Tek kohort koloniler başlangıçta bir kraliçe ve 0-2 gün eski işçileri kapsar. Birkaç gün koloniler kurduktan sonra, alm işçileriAynı yaşta ost farklı görevler üstlenecek. Diğer işçiler her zamankinden daha erken toplayıcı görevleri gerçekleştirmek ve böylece erken silaj denir oysa Bazı işçiler, tipik koloniler olarak hemşirelik görevleri gerçekleştirmek. Hemşire arılar ve erken toplayıcılar arasındaki gen ifadesi karşılaştırmaları işçi dokuların 12-16 rolü ile ilişkili fizyolojisi hakkında yararlı bilgiler sağlayacaktır. Burada, HPGler 16 rol ve / veya yaşa bağlı fizyoloji analizi için tek bir kohort koloniler hazırlamak için detaylı bir protokol açıklar. Ayrıca kısa bir süre HPG fizyolojisi değerlendirmek için niceliksel ters kopyalama-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile mrjp2 ve Hbg3 gen ekspresyonunu incelemek için açıklanmıştır.
Tek kohort kolonilerinde işçi fizyolojisi analizine ek olarak, endokrin sistemin incelenmesi rol ilişkili işçi fizyolojisi düzenleyici mekanizmaların analiz etmek için önemlidir. kullanımları bilinmektedir Jüvenil hormon (JH),Böcek larvaları 'statükonun' hormon gibi wn, işçi bal arılarının 11 kazarak için hemşirelik rolü kayması hızlandırır. Ayrıca, metamorfoz sırasında tüy dökümü hormonu olarak bilinen ekdison, mantar organları işçi beynin 17-19 daha yüksek bir merkezi ifade edilir ekdison sinyal molekülleri kodlayan genlerin olarak rol kayması dahil olabilir. Bu nedenle, biz de HPG fizyolojisi üzerindeki endokrin sistemin etkisinin analizi (ifadesi için ayrıntılı ekdisonla aktif formudur 20E işçileri tedavi önceki çalışmamızda 16 kullanılan protokol, ve methopiren, bir JH analog tanımlamak mrjp2 ve Hbg3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek kohort koloniler hazırlanması
Burada işçi arıların rolü kayması ile ilişkili HPG fizyolojisi analizi için tek kohort koloniler hazırlamak için önceki çalışmamızda 16 kullanılan protokol nitelendirdi. Prosedürler 1.6-1.7 ve Şekil 2'de açıklanan kriterleri karşılayıp Hemşire arılar ve erken silaj tek kohort koloniler (Tablo 1) gözlendi. HPG sınıflandırılması referans olarak devletler Şekil 2'de</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. . The insect societies. , (1971).
- Winston, M. L. . The biology of the honey bee. , (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN–description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
