Voorbereiding van de Single-cohort Colonies and Hormoon Behandeling van werkbijen Analyseer Physiology geassocieerd met Rol en / of endocriene systeem
Summary
Hier beschrijven wij onze gedetailleerde protocol voor de voorbereiding van de single-cohort bijenvolken – een nuttig instrument voor het analyseren van de role-geassocieerde werknemer fysiologie. We beschrijven ook gedetailleerde protocollen voor de behandeling van werknemers met juveniele hormoon en ecdyson de betrokkenheid van deze hormonen in de regulatie van de werknemer gedrag en / of fysiologie te evalueren.
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
De Europese honingbij, Apis mellifera, is een eusocial insect met een goed georganiseerde samenleving 1. Werkbijen (arbeids kaste) worden betrokken bij verschillende taken aan kolonie activiteit te behouden en deze taken veranderen al naar gelang de leeftijd van de werknemer honingbij na eclosion, die wordt aangeduid als leeftijdsgebonden arbeidsverdeling 2-4. Jonge werknemers (<13 dagen oud) verzorgen van het broed in de korf door het afscheiden van royal jelly (verpleegkundige bijen), terwijl oudere werknemers (> 15 dagen oud) nectar en stuifmeel te verzamelen buiten de korf (verzamelaars) 2-4. De fysiologie van de arbeiders veranderingen in verband met deze rol shift. Bijvoorbeeld, de functie van de hypofarynx klieren (HPGs), gekoppeld exocriene klieren in de kop, veranderingen in samenwerking met de rol verschuiving van verpleging tot 2,5 voederen. Verpleegster bijen HPGs vooral te synthetiseren grote royal jelly eiwitten, die belangrijke bestanddelen van bee melk. Aan de andere kant, forager HPGs hoofdzakelijksynthetiseren koolhydraat metaboliserende enzymen, zoals α-glucosidase III om nectar honing verwerken door het omzetten van sucrose in glucose en fructose. Onze eerdere studies is gebleken dat de expressie van mrjp2, die een belangrijke royal jelly eiwit en Hbg3 codeert, waarbij α-glucosidase III, codeert veranderingen in de rol shift 6-9.
Om te bepalen of de fysiologische veranderingen van de werknemer weefsels, waaronder de HPGs, wordt geassocieerd met de functie shift of de leeftijd van de arbeiders, zou het nuttig zijn de populatie samenstelling van een bijenkolonies manipuleren, zodanig dat één cohort bereiden kolonies waar werknemers van bijna dezelfde leeftijd uit te voeren verschillende taken 10,11. Robinson et al. (1989) beschreven een werkwijze voor het vaststellen van een cohort-kolonie 10. Single-cohort kolonies bevatten aanvankelijk een koningin en 0-2 dagen oude werknemers. Enkele dagen na de oprichting van de kolonies, de werknemers van de almost dezelfde leeftijd aannemen verschillende taken. Sommige werknemers voeren verpleegkundige taken in de typische kolonies, terwijl andere werknemers foerageergebied taken eerder dan gebruikelijk uit te voeren en zijn dus vroegrijpe verzamelaars genoemd. Genexpressie vergelijkingen tussen verpleegkundige bijen en vroegrijpe voedermachines zou nuttige informatie over de rol bijbehorende fysiologie van werknemer weefsels 12-16 bieden. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het bereiden één cohort kolonies voor analyse van de rol- en / of leeftijdgebonden fysiologie van HPGs 16. Ook korte beschrijving hoe de genexpressie van mrjp2 en Hbg3 onderzocht met kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (RT-PCR) voor het HPG fysiologie evalueren.
Naast de analyse werknemer fysiologie in enkelvoudige kolonies cohort onderzoek van het endocriene systeem is belangrijk voor het analyseren van de regelgeving van rollen geassocieerde worker fysiologie. Juveniel hormoon (JH), die known als de 'status quo' hormoon in insectenlarven, versnelt de verschuiving in de rol van verpleegkundige tot foerageren in werkbijen 11. Bovendien ecdyson, die bekend staat als het vervellen hormoon tijdens metamorfose, betrokken zouden kunnen zijn in de rol shift genen die coderen ecdyson signaalmoleculen zijn uitgedrukt in de mushroom bodies, een hogere midden van de werknemer hersenen 17-19. Daarom hebben we ook beschrijven gedetailleerd protocol gebruikt in onze vorige studie 16 werknemers met 20E behandelen, die een actieve vorm van ecdyson en methopreen, een JH analoog, voor de analyse van het effect van het endocriene systeem HPG fysiologie (expressie van mrjp2 en Hbg3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Voorbereiding van de single-cohort kolonies
Hier beschrijven we het protocol dat in onze vorige studie 16 enkelvoudige-cohort kolonies bereiden voor analyse van HPG fysiologie verband met de verschuiving van de rol van werkbijen. Verpleegkundige bijen en vroegrijpe verzamelaars dat de procedures 1,6-1,7 en Figuur 2 beschreven criteria voldoen werden waargenomen in de single-cohort kolonies (tabel 1). De foto in figuur 2 zou nuttig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. . The insect societies. , (1971).
- Winston, M. L. . The biology of the honey bee. , (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN–description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
