Préparation des colonies mono-cohorte et Traitement hormonal des travailleurs Honeybees à Analyser Physiologie Associé à Rôle et / ou le système endocrinien
Summary
Nous décrivons ici notre protocole détaillé pour la préparation de colonies d'abeilles seule cohorte – un outil utile pour analyser le travailleur physiologie rôle associé. Nous décrivons également des protocoles détaillés pour traiter les travailleurs avec l'hormone juvénile et ecdysone pour évaluer l'implication de ces hormones dans la régulation du comportement et / ou de la physiologie des travailleurs.
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
L'abeille européenne, Apis mellifera, est un insecte eusocial avec une société hautement organisée 1. Abeilles travailleurs (caste de travail) sont engagés dans diverses tâches pour maintenir l' activité de la colonie, et ces tâches changent en fonction de l'âge de l'abeille des travailleurs après l' éclosion, qui est désigné comme division du travail 2-4 liée à l' âge. Les jeunes travailleurs (<13 jours old) prendre soin de la couvée dans la ruche en sécrétant la gelée royale (infirmières des abeilles), tandis que les travailleurs plus âgés (> 15 jours old) recueillent le nectar et le pollen à l' extérieur de la ruche (butineuses) 2-4. La physiologie des travailleurs change en association avec ce rôle changement. Par exemple, la fonction des glandes hypopharyngiennes (de HPG), jumelé glandes exocrines situées dans la tête, des changements en association avec le rôle passage de soins infirmiers à la recherche de nourriture 2,5. HPG infirmière d'abeilles synthétisent majoritairement des protéines majeures de la gelée royale, qui sont les principaux composants du lait d'abeille. D'autre part, HPG butineuses principalementla synthèse des hydrates de carbone, les enzymes du métabolisme tels que α-glucosidase III, pour traiter le nectar en miel en convertissant le saccharose en glucose et fructose. Nos études antérieures ont révélé que l'expression de mrjp2, qui code pour une protéine de gelée royale majeure, et Hbg3, qui code pour α-glucosidase III, les changements au cours du rôle déplacement 6-9.
Pour déterminer si les changements physiologiques dans les tissus des travailleurs, y compris les HPG, est associé au rôle décalage ou avec l'âge des travailleurs, il serait utile de manipuler la composition de la population d'une colonie d'abeilles, comme pour préparer une seule cohorte colonies dans lesquelles les travailleurs de presque le même âge effectuer différentes tâches 10,11. Robinson et al. (1989) ont décrit un procédé pour établir une colonie unique cohorte 10. colonies mono-cohorte comprennent d'abord une reine et 0-2 jour anciens travailleurs. Plusieurs jours après avoir établi les colonies, les travailleurs de almost le même âge assumer des tâches différentes. Certains travailleurs effectuent des tâches de soins infirmiers dans les colonies typiques, alors que d'autres travailleurs effectuent des tâches butinage plus tôt que d'habitude et sont donc appelés butineuses précoces. Comparaisons d'expression génique entre les infirmières et les abeilles butineuses précoces fournirait des informations utiles sur la physiologie de rôle associé à des tissus des travailleurs 12-16. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la préparation de colonies seule cohorte pour l' analyse de la physiologie de rôles et / ou associée à l' âge de 16 HPG. Nous avons également décrit brièvement comment examiner l'expression du gène de mrjp2 et Hbg3 par inversion quantitative réaction en chaîne par polymérase-transcription (RT-PCR) pour évaluer HPG physiologie.
En plus de l'analyse des travailleurs de la physiologie dans les colonies seule cohorte, l'examen du système endocrinien est important d'analyser les mécanismes de régulation de rôle associé travailleur physiologie. hormone juvénile (JH), qui est known comme l'hormone «statu quo» dans les larves d' insectes, accélère le changement dans le rôle de soins infirmiers à la recherche de nourriture chez les abeilles ouvrières 11. En outre, ecdysone, qui est connu comme l'hormone de mue durant la métamorphose, pourrait être impliqué dans le rôle de changement des gènes codant pour des molécules de signalisation de l' ecdysone sont exprimées dans les corps pédonculés, un centre supérieur du cerveau des travailleurs 17-19. Par conséquent, nous décrivons également le protocole détaillé utilisé dans notre étude précédente 16 pour traiter les travailleurs avec 20E, qui est une forme active de ecdysone, et méthoprène, un analogue de JH, pour l' analyse de l'effet du système endocrinien sur HPG physiologie (expression de et mrjp2 Hbg3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Préparation des colonies mono-cohorte
Ici , nous avons décrit le protocole utilisé dans notre étude précédente 16 pour préparer des colonies mono-cohorte pour l' analyse des HPG physiologie associée au changement dans le rôle des abeilles ouvrières. Abeilles infirmières et butineuses précoces qui ont satisfait aux critères décrits dans les procédures 1,6-1,7 et la figure 2 ont été observées dans les colonies une seule cohorte (tableau…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
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