단일 코호트 식민지와 노동자 꿀벌의 호르몬 치료의 준비 역할 및 / 또는 내분비 시스템과 생리학 관련 분석하기
Summary
여기에서 우리는 단일 코호트 꿀벌 식민지의 제조를위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명 – 롤 관련 근로자의 생리를 분석하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 또한 작업자의 행동 및 / 또는 생리 조절에 이러한 호르몬의 참여를 평가하기 위해 청소년 호르몬과 에크 디손과 근로자를 치료하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
유럽 꿀벌, API를 mellifera이는 고도로 조직 된 사회 (1)와 eusocial 곤충이다. 작업자 꿀벌 (노동 계급) 식민지 활동을 유지하기 위해 다양한 작업에 종사하고 있으며, 이러한 작업은 노동 2-4의 연령과 관련된 부문이라고 우화 후 작업자 꿀벌의 연령에 따라 변경합니다. 젊은 노동자 (<십삼일 세) 고령 근로자는 동안, 로얄 제리 (간호사 꿀벌)을 분비하여 하이브에 무리를 돌봐 (> 15 일)는 하이브 (초지) 2-4 이외의 꿀과 꽃가루를 수집합니다. 노동자의 생리는이 역할 변화와 관련하여 변경합니다. 예를 들어, 하인두암 샘 (HPGs)의 기능은 2,5를 구하고으로 간호의 역할 변화와 관련 외분비 머리에있는 땀샘, 변화를 쌍. 간호사 꿀벌 HPGs는 주로 꿀벌 우유의 주요 구성 요소 주요 로얄 젤리 단백질을 합성. 한편, 주로 사일리지의 HPGs포도당과 과당 수크로오스로 변환하여 허니에 꿀을 처리하기 위해, 예컨대 α 글루코 III 탄수화물 대사 효소를 합성한다. 우리의 이전 연구는 밝혀 그 역할 변화 6-9시 α – 글루코시다 III, 변경 내용을 암호화하는 주요 로얄 젤리 단백질 및 Hbg3를 인코딩 mrjp2의 표현.
HPGs 포함 작업자 조직에서 생리적 변화는, 롤 시프트 또는 작업자의 나이와 관련되어 있는지 여부를 확인하기 위해, 단일 집단을 조제 같은 꿀벌 콜로니 인구 조성물을 조작하는 것이 유용 할 것이다 식민지는 거의 같은 나이의 노동자들은 다른 작업 10, 11을 수행합니다. 로빈슨 등의 알. (1989)는 단일 콜로니 10 코호트를 구축하는 방법을 설명했다. 단일 코호트 식민지 초기에 여왕과 0~2일 된 근로자를 포함한다. 며칠 식민지를 설정 한 후, ALM의 노동자같은 나이 OST 다른 작업을 가정합니다. 다른 근로자가 평소보다 일찍 꼴 작업을 수행함으로써 조숙 한 초지라고하는 반면 일부 노동자들은 전형적인 식민지로 간호 작업을 수행합니다. 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지 사이의 유전자 발현 비교는 노동자 조직 12-16의 역할 관련된 생리에 대한 유용한 정보를 제공 할 것이다. 여기, 우리는 HPGs (16)의 역할 – 및 / 또는 연령 관련 생리학의 분석을 위해 단일 코호트 식민지를 준비하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 또한 간단히 HPG 생리학을 평가하기 위해 정량적 역전사 – 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 mrjp2 및 Hbg3의 유전자 발현을 확인하는 방법을 설명한다.
단일 코호트 식민지에서 노동자 생리학의 분석뿐만 아니라, 내분비 시스템의 검사 역할 관련 작업자 생리의 규제 메커니즘을 분석하는 것이 중요하다. 알것입니다 청소년 호르몬 (JH)곤충 애벌레의 '현 상태'호르몬과 같은 WN, 작업자 꿀벌 11 꼴에 간호의 역할에 변화를 가속화합니다. 또한, 변형하는 동안 털갈이 호르몬으로 알려져있다 에크 디손은, 버섯 몸에 작업자 뇌 17-19의 높은 중심을 표현 에크 디손 신호 분자를 코딩하는 유전자와 같은 역할 변화에 관여 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 또한 HPG 생리학의 내분비 시스템의 효과 분석 (의 발현에 대한 자세한 에크 디손의 활성 형태 20E 근로자를 치료하기 위해 우리의 이전 연구 (16)에 사용되는 프로토콜 및 methoprene하는 JH 아날로그를 설명 mrjp2 및 Hbg3).
Protocol
Representative Results
Discussion
단일 코호트 식민지의 제조
여기에서 우리는 일벌의 역할의 변화와 관련된 HPG 생리학의 분석을 위해 단일 코호트 식민지를 준비하는 우리의 이전 연구 (16)에서 사용되는 프로토콜을 설명했다. 절차 1.6-1.7 및 그림 2에 설명 된 기준을 만족 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지는 단일 코호트 식민지 (표 1)에서 관찰되었다. HPG의 분류 기준으로 미국에?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
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