Summary
Una metodologia efficace e semplice per l'analisi computer basato su un comportamento nuoto nematode in un liquido è descritto. Il metodo richiede poco o nessun investimento per C. elegans laboratori. L'hardware utilizzato è standard, e il software per l'analisi comportamentale (Celest) è un open source uno.
Abstract
Analisi dei circuiti neuronali e neuromuscolari che regolano il comportamento rimane una sfida importante in biologia. Il nematode Caenorhabditis elegans ha dimostrato di essere un organismo modello prezioso per aiutare ad affrontare questa sfida, da ispirare approcci tecnologici, la costruzione del connettoma cervello umano, di spargimento in realtà luce sui fattori molecolari specifici di modelli funzionali di base. La maggior parte degli studi comportamentali in C. elegans sono state eseguite su substrati solidi. Nel liquido, animali mostrano modelli comportamentali che includono il movimento ad una gamma di velocità in 3D, così come i movimenti corporei parziali, come un ricciolo posteriore senza cambiare forma anteriore, che introducono nuove sfide per la quantificazione. Le fasi di una procedura semplice, e l'uso di un software che consente l'analisi ad alta risoluzione di C. elegans nuotare comportamento, sono presentati qui. Il software, chiamato Celest, utilizza un programma informatico specializzato che tiene tracciapiù animali contemporaneamente e rende disponibili nuove misure di C. elegans locomozione in un liquido (nuoto). Le misure sono per lo più radicati nella postura degli animali e sulla base di matematica utilizzati in computer vision e pattern recognition, senza requisiti di calcolo per la soglia cut-off. Il tool software può essere utilizzato sia per valutare abilità complessiva nuoto in centinaia di animali provenienti da studi piccoli lotti combinati e rivelare nuovi fenotipi anche in mutanti genetici ben caratterizzati. La preparazione dei campioni per l'analisi con celest è semplice e low-tech, che consente un'ampia adattamento da parte della comunità scientifica. L'utilizzo del metodo di calcolo descritto qui dovrebbe pertanto contribuire alla maggiore comprensione del comportamento e circuiti comportamentali nel modello di elegans C..
Introduction
Definire come il comportamento genetica, epigenetica, l'esperienza e l'ambiente influenza è una sfida importante nella biologia moderna. Semplice, modelli geneticamente suscettibili che possono essere computazionalmente monitorati e misurati possono dare un contributo critico verso questo obiettivo. Nematode Caenorhabditis elegans è uno di questi modelli. Lo scopo di questo articolo è quello di dimostrare come C. elegans nuoto locomozione possono essere monitorati e quantificati per estrarre informazioni su otto nuove caratteristiche di rilevanza biologica.
C. elegans ha una vita relativamente breve di circa 2 - 3 w ed un periodo riproduttivo di circa 4 d a 20 ° C 1,2. Nelle culture standard di laboratorio, questo nematode microscopica è coltivato su piastre di Petri contenenti nematode crescita media (NGM) che si diffondono con una fonte di cibo batterica 3,4. animali WT N2 si muovono attivamente eleganti onde sinusoidali su piastre di agar-riempita; cambiano il movimento rattoes durante il roaming (in cerca di cibo), abitazione (browsing), o il recupero da un pasto (quiescenza sazietà inattivo) 5. Impairment 6 o 7-12 età possono anche alterare drammaticamente il movimento su piastre.
I geni che modulano il comportamento, Healthspan o di invecchiamento, possono essere funzionalmente caratterizzati analizzando C. elegans schemi di movimento o la locomozione. Un approccio per misurare healthspan è quello di classificare gli adulti di invecchiamento in tre categorie (ad esempio, A, B, e C) a seconda della loro locomozione su piastre, con attività vigorosa fisica di essere di classe A e la paralisi di essere classe C 7,8,13. Anche se tale ordinamento qualitativo è utile per rivelare le differenze di forma fisica, le categorie sono ampio, senza chiari confini e quindi la loro punteggio è soggetto a sperimentatore bias.
Un numero crescente di inseguitori hanno elevato l'obiettività, la raffinatezza e la precisione dell'analisi di C. elegans movimentosu terreni solidi 14-18. C. elegans locomozione su piatti principalmente è limitato al piano in cui l'animale entra in contatto con la superficie solida del supporto. (C. elegans possono indurre esplorazione sollevando la testa dal resto del corpo che è ancora in contatto con una superficie solida, posizionando il corpo in piani multipli. Tuttavia, questo comportamento è insolito.) Quando posto in un liquido, questo nematode avvia un movimento ondulatorio, o il nuoto, che dispone di più ampio movimento tridimensionale, una più ampia gamma di velocità e profondità di movimento, e una maggiore incidenza con l'età del anteriore muoversi in modo diverso da posteriore rispetto agli animali su superfici solide. Come una rapida analisi di idoneità fisica e la risposta al nuovo ambiente, uno sperimentatore può inserire un singolo animale in una goccia di liquido e segnare la sua frequenza di curve del corpo nell'ambito di applicazione dissezione. La registrazione video può facilitare rigature presenti e future del vigore del nuotoanimale. Tuttavia, l'approccio manuale limita il numero di caratteristiche che possono essere segnati, ed è completamente vincolato al gol un animale alla volta.
Locomozione in liquido è stato meno esplorato di locomozione su un supporto solido. Infatti, ci sono alcune opzioni software che sono robusti e facili da implementare in laboratorio per misurare la locomozione in liquido 19-24. Il Celest software (C. elegans prova di nuoto) offre la semplicità di misure di uso e matematiche-based che forniscono dati (i punteggi curvatura) direttamente rilevanti per la natura del moto 8; (descrizione dettagliata delle caratteristiche e vantaggi in Restif et al. 8). Inoltre, l'analisi computazionale consente la delucidazione delle caratteristiche fenotipiche che sono impossibili per l'occhio umano di segnare. Qui, i dati che esemplificano la risoluzione di questo approccio di analisi sono presentati e un facile da implementare il protocollo per registrare le prove di nuoto per la successiva analisi celest è descritto.
Protocol
1. Nematode crescita e Manipolazione
- Grow C. elegans su piastre di Petri standard contenenti NGM macchiato con OP50-1 Escherichia coli come fonte di cibo 1-3.
- Mantenere culture in un incubatore che mantiene la temperatura desiderata. C. elegans cresce bene da 15 a 25 ° C, a 20 ° C è la temperatura di crescita standard.
NOTA: Il nuoto è un fenotipo robusta, tuttavia nuotare vigore può essere influenzata da fattori ambientali, tra cui la contaminazione su piastre e il surriscaldamento delle culture e delle diapositive. sforzi forti per mantenere condizioni di stabilità dovrebbero essere. - Utilizzare un pick nematode fatta in casa di un filo di platino fiamma sigillato in una bacchetta di vetro per gestire il trasferimento di singoli animali 4.
2. Impostare per l'analisi Swim
- Utilizzare un sistema integrato costituito da un stereomicroscopio, fotocamera CCD digitale e software di registrazione video digitale. Il Software CA Celestn essere utilizzato su un computer separato.
- Coprire il microscopio con un panno scuro (ad esempio, feltro) per evitare l'abbagliamento nell'area goccia nuotata sul vetrino da microscopio e migliorare la qualità dell'immagine.
- Regolare distanza di lavoro del microscopio e l'ingrandimento alla piena vista della zona di nuoto, e lo specchio di base per ottenere netto contrasto degli animali sullo sfondo. Impostare l'illuminazione a campo scuro di visualizzare i corpi degli adulti bianchi sullo sfondo nero, che funziona molto bene per la visualizzazione computazionale e di monitoraggio con il software di analisi di nuoto.
- Fare attenzione a mantenere l'area di lavoro, vetrino da microscopio, e nuotare cadere molto pulito. I detriti possono interferire con l'analisi occludendo il nuoto libero degli adulti, e sottili fili di fibra può essere rilevato come fissa a animali durante il monitoraggio.
3. Preparazione degli animali per l'analisi di idoneità fisica a liquido
- Pipettare 60 ml of 1x M9 tampone in un anello di 10 millimetri prestampato su un vetrino da microscopio. Assicurarsi che il calo copre interamente l'area all'interno del ring. Il software estrae ulteriori informazioni nuoto utilizzando questo formato goccia contenute in una diapositiva di quanto lo sarebbe se utilizzando piastre a pozzetti multipli.
- Raccogliere singoli nematodi adulti e trasferirli nella goccia di 1x tampone M9, minimizzando il trasporto di batteri che possono offuscare il liquido. Ridurre al minimo i batteri prima immissione degli animali per il trasferimento ad un lato del piatto che non contiene molto prato batterica, permettendo loro di eseguire la scansione, e poi delicatamente sollevandole.
- Quando si trasferiscono i nematodi nella goccia, utilizzare un ambito dissezione vicino alla stazione di analisi per ridurre la lunghezza del tempo di nuoto, che può influenzare il comportamento degli animali 25.
- Mettere solo 4 adulti in calo se si muovono vigorosamente e si incrociano spesso. Come guida per ridurre al minimo i nuotatori sovrapposizione (che confonde l'analisi computazionale), provare a inserire4 animali per caduta quando sono così attivi come i giovani, gli adulti WT sani e 5 animali per caduta quando sono più grandi e mostrano meno vigore.
NOTA: nematodi sano WT istintivamente iniziano a nuotare subito dopo di essere immessi in un liquido. Con l'aiuto di un pick nematode, separare delicatamente gli adulti nella goccia se aggregano.
4. Analisi della forma fisica in Liquido - Registrazione Video di Nuoto
- Posizionare il vetrino caricato con adulti sulla base del microscopio per registrare il nuoto. 30 s dettagli video cattura del comportamento di un singolo animale a liquido (Video 1), e il campionamento di un gran numero di tali registrazioni è facilmente realizzabile quando l'aiuto di un software Celest 8,26; tuttavia, nuotare più periodi possono essere l'ideale per gli altri studi comportamentali specifici 25. È importante sottolineare che, assicurarsi di mantenere lo stesso ingrandimento in tutte le registrazioni in quanto le differenze di ingrandimento affetto,t analisi nuoto e confronto sarà bias.
NOTA: Questi passaggi sono forniti come guida utilizzando il software di registrazione video digitale elencati nella tabella dei materiali; VirtualDub software accesso aperto potrebbe sostituire, anche se non abbiamo testato questo.- Utilizzare le seguenti impostazioni come guida per l'analisi nuotata di successo: le dimensioni dell'immagine di 696 x 520 pixel, risoluzione dell'immagine di 0,02 mm / pixel, e un tasso di 18 fotogrammi / s. versioni ad alta risoluzione di queste impostazioni possono facilitare il monitoraggio, ma non influiranno sulle misure calcolati dal programma.
NOTA: La zona di nuoto fornito dal calo del 60 ml di tampone 1x M9 sul vetrino da microscopio non ha molta profondità, che riduce al minimo verso l'alto e verso il basso movimento natatorio.
- Utilizzare le seguenti impostazioni come guida per l'analisi nuotata di successo: le dimensioni dell'immagine di 696 x 520 pixel, risoluzione dell'immagine di 0,02 mm / pixel, e un tasso di 18 fotogrammi / s. versioni ad alta risoluzione di queste impostazioni possono facilitare il monitoraggio, ma non influiranno sulle misure calcolati dal programma.
- In Impostazioni, andare a 'Registrazione', impostare 'limite di formato Sequenza' a '545 fotogrammi su disco'. Sotto la stessa voce, selezionare la casella 'Use Recording Manager'. Fai clic su 'Modifica Recor correntesceneggiatura ding ... 'pulsante, e sotto' comandi ', selezionare' Grab Frame ', e sotto la' stop Condizioni ', inserire' fermata dopo 0: 00: 30.00 '.
- Per registrare, selezionare 'Nuova sequenza nella RAM' sotto il titolo di casa, quindi premere il tasto 'Record' rosso. Il software catturerà 545 fotogrammi oltre 30 s con la fotocamera digitale e tenerli in memoria RAM.
5. Analisi di idoneità fisica a Liquido - Trattamento Video
- Frammentare il video in una sequenza di fotogrammi dell'immagine facendo clic sul titolo di casa e selezionando 'intera sequenza Esporta ...' nel software di registrazione video.
NOTA: Il software di registrazione video digitale in grado di salvare i fotogrammi come .bmp, .jpg, .tif o .png, ognuno dei quali può essere letto dal programma di analisi nuotare qui presentata. Si noti che .tif file utilizzano più spazio di archiviazione, ma alcuni formati quali .jpg possono degradare la qualità dell'immagine. - Avviare il programma di analisi nuotata da MATLAB By clic sul pulsante Esegui.
- Nella schermata iniziale del programma di analisi nuotata, utilizzare il 'Aggiungi un video' o 'Aggiungi multipli video' pulsanti per caricare le sequenze di immagini fotogrammi uno alla volta o in gruppi, mentre connessi etichette importanti come il genotipo, la data, prova e la durata . Il software crea un database di sequenze etichettati.
- Attiva il monitoraggio simultaneo di più animali nelle sequenze caricati facendo clic su "1. Processo video '. Nella nuova schermata, selezionare i video desiderati nel riquadro di sinistra e fare clic su, 'Aggiungi alla lista'. Per ogni video, fare clic sul suo nome nella lista in alto a destra per visualizzare la prima immagine del video in basso a destra. Delimitare la zona di nuoto selezionando 3 punti dentro l'anello, e di avviare l'elaborazione cliccando su 'Processo di tutti i video di cui sopra'. Guarda i progressi del trattamento in basso al centro.
- Una volta completato, 'Chiudi' la schermata di elaborazione video.
6. L'analisi della forma fisica in Liquid - Misurazione
- Fare clic su '2. misure di calcolo 'per aprire una nuova schermata in cui i video elaborati possono essere caricati, uno alla volta, per convalidare o rifiutare la tracciabilità dei singoli animali. Video che sono stati elaborati appariranno nella lista di sinistra in cui il nome del video può essere cliccato per caricare il video.
- Utilizzare questo passaggio manuale di concentrarsi sulle aree di mancate di inseguimento (blocchi rossi) in contrasto con il monitoraggio di successo (blocchi verdi).
NOTA: In alternativa, si può contare sulla produzione automatizzata di monitoraggio valido dal momento che il software ha un robusto sistema di monitoraggio (94,1% validità come osservato in 2.020 animali di 404 video 8).- Trovare la 'validità del corpo segmentato' nella prima barra dei colori sullo schermo nella metà inferiore. La percentuale di "cornici di valida è di colore verde, e la percentuale di" frame rifiutati "è in rosso. ≥80% di fotogrammi validi implica che l'i inseguimentonformazioni utilizzato per calcolare le misure viene da almeno 432 fotogrammi su 540 in un 30 s nuotata processo registrato a 18 fotogrammi / s.
- Facilmente navigare e modificare blocchi di validità / respinto fotogrammi che utilizzano il 'blocco successivo', 'interruttore di validita', 'blocco Split', e le opzioni di 'cornice Isolare. Nel raro caso in cui 2 animali hanno attraversato i percorsi in una zona di nuoto poco affollata, passare i loro numeri di identificazione in un determinato intervallo di fotogrammi con il tasto 'Switch'.
- Visualizzare i grafici a barre nella metà inferiore dello schermo per ulteriori informazioni sulla tracciabilità e performance si sovrappongono. La lunghezza del corpo segmentato (lunghezza del corpo dell'animale per frame) correla con sovrapposizione incidenza.
- Se i punti luminosi sul video interferiscono con l'analisi, regolare le aree luminose nella zona di nuoto selezionando la funzione "Glare zone".
- Fare clic su 'Salva e misure Calcola' per salvare l'ingresso validità dinanzi upil caricamento di un altro video elaborato. A questo punto il software calcola, in background (non mostrato per l'utente), mappe curvatura delle prestazioni nuoto dei singoli animali ed i parametri indicati di seguito (Video 2).
NOTA: I parametri misurati che si concentrano qui sono descritti nella Tabella 1. The Wave tasso di iniziazione, il numero onda del corpo, l'asimmetria, stretch, e curling sono calcolate sulla base delle mappe di curvatura che il software calcola per gli animali; la velocità di traslazione, pennellata e l'attività parametri indice non sono basate su mappe di curvatura. - Fare clic su 'Chiudi' per uscire dalla schermata delle «misure Calcola '.
7. Analisi di idoneità fisica a Liquido - Uscita dei risultati
Nota: Il software può riferire su più misure del moto di nuoto, che coprono da evidenti a molto sottili tratti comportamentali non facilmente segnati da occhio (Video 3 e 4). Qui laattenzione è rivolta a 8 parametri che mostrano in genere una buona gamma dinamica: Saluto del tasso di iniziazione, numero onda del corpo, l'asimmetria, Stretch, Curling, velocità di traslazione, pennellata, e l'indice di attività.
- Nella schermata iniziale del programma, fare clic su '3. Mostra risultati 'per ottenere l'output di analisi.
- Creare gruppi di esempio per il trattamento statistico selezionando le sequenze analizzate di fotogrammi desiderato nel riquadro a sinistra e il loro trasferimento in un nuovo o esistente campione facendo clic sui pulsanti 'Aggiungi al campione selezionato' o 'Aggiungi al nuovo campione.
- Fai clic su "Mostra grafici per questi campioni 'per andare a un secondo schermo che visualizza i grafici e statistiche chiave dei campioni per ciascuno degli 8 parametri di selezione sulla parte superiore dello schermo.
- Se lo si desidera, regolare la rappresentazione dei grafici a barre in alto a sinistra dello schermo utilizzando i 'Colori', '# di istogrammi', e '#' di vermi selettori.
- Uso'Istogrammi 2D' per tracciare le combinazioni di qualsiasi coppia di parametri tramite il 'Misura sull'asse X' e 'Misura sull'asse Y' menu a tendina sulla sinistra dello schermo. Fare clic su 'Chiudi' per uscire e tornare alla schermata 'Risultati'.
- Utilizzare il 'Esporta ...' pulsante in alto a sinistra dello schermo per salvare i dati numerici dettagliati come file .csv per aprire e manipolare ulteriormente in un foglio di calcolo.
- schermo 'display risultati' 'Close' per tornare alla schermata iniziale e fare clic su 'Quit' per garantire il risparmio del database contenente le sequenze video analizzati.
Representative Results
Analizzando locomozione in un liquido (nuoto), fenotipi che non sono immediatamente evidenti su un supporto solido (strisciando) possono essere chiarite. Per quantificare il nuoto locomozione abbiamo sviluppato un software specifico che misura dieci nuovi parametri di comportamento nuoto 8. Gli otto più utile di questi parametri sono descritti in dettaglio nella Tabella 1. Questi parametri sono chiamati Saluto tasso di iniziazione, il numero onda del corpo, Asimmetrico, Stretch, Curling, Velocità di traslazione, colpo della spazzola, e un indice di attività. Gli studi che esemplificano la potenza del software hanno definito il declino funzionale di centinaia di invecchiamento adulti con WT, sfondi comportamentali o longevità mutante 8, e hanno analizzato il ben studiato mutanti longevità età-1 (hx546) e daƒ-16 (mgDƒ50), che porto mutazioni che inficiano il normale percorso di segnalazione dell'insulina. L'età-1 gene codifica per una phosphatidylinositide 3-chinasi (PIK3) Subunità catalitica, e, quando si ospita il hx546 mutazione, provoca l'estensione durata e resistenza allo stress 27-29. Il gene daƒ-16 codifica per un fattore di trascrizione forkhead box O (FOXO) che accorcia la durata della vita e compromette la risposta allo stress quando cancellato 30-33.
Alcuni parametri di nuoto come Saluto tasso di iniziazione, la velocità di viaggio, pennellata e un indice di attività gradualmente diminuita con l'età, anche in background genetico favorevoli (Figura 1). In linea con le attuali conoscenze, longevo età-1 (hx546) mutanti hanno mostrato un rendimento fisico più vigoroso di WT in età avanzate ed estremamente vecchi. Inoltre, come anticipato, di breve durata daƒ-16 (mgDƒ50) mutanti visualizzata compromesse le prestazioni, soprattutto a velocità estremamente vecchi età. Sorprendentemente, è stato solo sotto il controllo del computer vision celest e pacchetto algoritmo matematico che il superioR prestazioni nuotata di età-1 (hx546) mutanti era rilevabile al momento della comparsa della vita adulta. Il fatto che l'età-1 (hx546) si traduce in migliori prestazioni fisiche al giovane vita adulta suggerisce che questa mutazione colpisce lo sviluppo normale e / o giovani adulti fenotipo in un modo precedentemente non apprezzato (Figura 1).
Numero onda del corpo, l'asimmetria, stirata, e curling parametri i trend con l'età in WT e invecchiamento adulti mutanti (Figura 2). È interessante notare che il livello di risoluzione del software ha rivelato tratti comportamentali più fini come la simmetria sostenuto di mutanti in tutto il loro ciclo di vita e l'incapacità di daƒ 16-(mgDƒ50) mutanti estrema vecchiaia-1 (hx546) per allungare e rannicchiarsi nella misura in cui lo stesso age WT ed età-1 (hx546) adulti.
Oltre alla inevitabile perdita complessiva di perfo fisicarmance a causa dell'età, ogni individuo adulto visualizza un motivo progressione unico attraverso il processo di invecchiamento, anche se la genetica e l'ambiente sono praticamente omogeneo 7. (Controllando la genetica e l'ambiente, i possibili effetti confondenti di questi fattori sono ridotti al minimo, svelando il contributo significativo di stocasticità alla degenerazione legata all'età.) Un sincronizzato C. elegans popolazione di background genetico simile conservato in un ambiente controllato contiene ancora un mix di diverse classi di individui secondo le loro peculiarità di invecchiamento. Anche se tutti partono come gli adulti in buona salute, alcuni perdono rapidamente la loro forma fisica (agers cattivi, classe C), mentre altri mantengono vigore per il periodo di tempo più lungo (agers aggraziate, classe A). Bad agers appaiono così ad avere un healthspan sensibilmente inferiore a agers aggraziate.
Come ulteriormente descritto nel nostro studio 8, ager graziose mantenuti giovanile fitn fisicoess come osservato rispetto al profilo nuotata di adulti molto più giovani (figure 3, 4 e 5). Questa forma fisica sostenuta è paragonabile alla prestazione fisica di-1 di età (hx546) mutanti longevi all'età post-riproduttiva (D 11) (figure 1 e 2). Al contrario, cattivi ager drammaticamente perso molto della loro capacità fisica subito dopo la riproduzione, eseguendo a livelli simili a quelli di daƒ-16 (mgDƒ50) adulti vecchi e progeric estreme (figure 1 - 4). Queste somiglianze possono essere tratte dal confronto lordo, tuttavia particolari firme sono facilmente visibili ad uno sguardo più attento. Per esempio, anche se vi è una correlazione tra il grado di entrambi stretch e curling tipi selvatici vecchi estreme e mutanti invecchiamento (figura 2), questa relazione non è osservata in cattive ager (figure 4 e 5), che mostrano maggiore propensione ad arricciarsi up, manon allungare nei campioni testati. Il software presentiamo aggiunge pertanto dimensione all'analisi di forma fisica o di capacità locomotoria fornendo gli strumenti per studi più sofisticati che non erano trattabili prima. In sintesi, celest fornisce letture complete sotto forma di otto misure innovative evidenziati qui, che definiscono l'impronta digitale del comportamento di specifici genetica, epigenetica, e sfondi ambientali che consenta l'identificazione di modelli dei parametri unici e comuni che possono essere le firme di condizioni specifiche ( ambientale, farmacologico, alimentare), i processi biologici, o organismo stati come healthspan.
Figura 1: Report Software celest sull'onda Initiation Rate (A), indice di attività (B), Pennellata (C) e la velocità di (D) per la WT, età-1 (hx546), e daƒ-16 (mgDƒ50) Adulti su D 4 (giovani in età adulta), 11 (post-riproduzione) e 20 (estrema vecchia). '#' Nel 'numero' Y significa assi. WT sono colorati in grigio, l'età-1 in verde e daƒ-16 in rosso. Le barre di errore sono l'errore standard della media (SEM). WT Same-età e mutanti di invecchiamento sono stati confrontati per la significatività statistica utilizzando uno ANOVA seguita dal test di confronto multiplo di Dunnett. **, P = 0,001 - <0.01; ***, P = 0,0001 - <0.001. n = 62 in ogni dati del punto da quattro studi indipendenti. Si noti che qui, e per la Figura 2, ogni singolo 30 s il video è realizzato con 4 animali, e per ogni prova abbiamo segnare un totale di 16 animali da 4 video nuotare, questo è fatto per 4 repliche biologiche per ogni punto di dati indicato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rapporti software sul corpo Wave Number (A), asimmetria (B), Stretch (C), e Curling (D) per la WT, età-1 (hx546) e (mgDƒ50) Adulti su D 4 16 daƒ-(giovane l'età adulta), 11 (post-riproduzione) e 20 (estrema vecchia). '#' Nel 'numero' Y significa assi. WT sono colorati in grigio, l'età-1 in verde, e DAF-16 in rosso. Le barre di errore sono l'errore standard della media (SEM). WT Same-età e mutanti di invecchiamento sono stati confrontati per la significatività statistica utilizzando uno ANOVA seguita dal test di confronto multiplo di Dunnett. *, P = 0,01 - <0,05; **, P = 0,001 - <0.01; ***, P = 0,0001 - <0.001. n = 62 in ciascun punto di dati da quattro indipendenti, 30 s nuotare prove.e.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rapporti Software sull'onda Initiation Rate (A), indice di attività (B), Pennellata (C), e la velocità di (D) per i giovani adulti WT (D 4), e della stessa età Grazioso e Bad Agers (D10 e 11). '#' Nel 'numero' Y significa assi. I giovani WT sono colorati in grigio, classe A grazioso ager in verde, e di classe C cattivi agers in rosso. Le barre di errore sono l'errore standard della media (SEM). Classe A grazioso agers e di classe C cattivi agers sono stati confrontati con D 4 giovani adulti utilizzando uno ANOVA seguito dal test di confronto multiplo di Dunnett. ****, P <0,0001. n = 27 in ciascun punto di dati da due indipendenti, 30 s nuotare prove. Graph è leggermente modificata da Restif et al. (2014) 8, che è stato pubblicato sotto CreativeAttribuzione (CC BY) licenza http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rapporti Software sul corpo Wave Number (A), asimmetria (B), e Curling (C) per Young WT adulti (D 4), e Age della stessa età aggraziati e Bad (D 10 e 11). '#' Nel 'numero' Y significa assi. I giovani WT sono colorati in grigio, classe A graziose ager in agers verdi e di classe C cattivi in rosso. Le barre di errore sono l'errore standard della media (SEM). Classe A grazioso agers e di classe C cattivi agers sono stati confrontati con D 4 giovani adulti utilizzando uno ANOVA seguito dal test di confronto multiplo di Dunnett. **, P = 0,001 - <0.01; ****, P <0,0001;
Figura 5: Software Relazione sulla Stretch per giovani adulti WT (D 4), e della stessa età Grazioso e Bad Agers (D 10 e 11). I giovani WT sono colorati in grigio, classe A graziose ager in agers verdi e di classe C cattivi in rosso. Le barre di errore sono l'errore standard della media (SEM). Classe A agers aggraziati e di classe C cattivi agers sono stati confrontati con D 4 yadulti Oung utilizzando ANOVA a senso unico seguito da test di confronto multiplo di Dunnett. n = 27 in ogni dato punto in due prove indipendenti. Graph è leggermente modificata da Restif et al. (2014) 8, che è stato pubblicato sotto la licenza Creative Commons Attribuzione (CC BY) licenza http: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Video 1: nuoto di un gruppo rappresentativo di C. elegans adulti. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
Video 2: celest Software di calcolo delle singole curvatura Mappe delle prestazioni bagno della animali testati. mappe di curvatura sono calcolati in background; essi non appaiono nel software di interfaccia con l'utente. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
Video 3: il calcolo del software delle misure di nuoto sulla base di singoli Mappe di curvatura. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
Video 4: Software di calcolo delle misure da bagno che non si basano sulla curvaturaMappe. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
Discussion
L'uso di C. elegans come sistema modello continua ad aumentare a causa della sua malleabilità genetica, trattabilità sperimentale e l'anatomia annotata in particolare meticoloso. Per esempio, la struttura neuronale e la connettività del C. elegans ermafrodita è ben tracciato 34-36, notevolmente facilitare le indagini su specifici circuiti neuronali che controllano i comportamenti particolari. 302 neuroni costituiscono il sistema nervoso del ermafrodita adulti, trattano una vasta gamma di input sensoriali in output comportamentali di base come la locomozione. La struttura del più complesso sistema nervoso maschio è stato anche descritto 37, consentendo circuiteria sesso da affrontare. 37
C. elegans comportamento è stato ampiamente studiato su piastre di coltura standard contenenti terreni solidi. Dal momento WT C. elegans si muove in onde sinusoidali prevedibili su piastre di agar-riempita, deviazioni dallaschema generale può essere rilevata a occhio e ha ottenuto manualmente. Questo approccio, tuttavia, è soggetto a criteri dello sperimentatore ed è laborioso. Strumenti hardware e software progettati per monitorare e misurare C. elegans locomozione su un supporto solido rimuovere il bias soggettività e consentono di studi su larga scala, permettendo più sofisticate questioni biologiche da affrontare. Il database comportamentale recente creato da laboratorio Schafer 16 è un ottimo esempio del prolungamento analitico e la profondità che è stato realizzato con un sistema di calcolo per la locomozione su piastre.
Quando WT C. elegans è collocato in un liquido, l'animale si adatta rapidamente il suo movimento al nuovo ambiente, l'avvio di una nuotata. C. elegans nuoto utilizza una maggiore ampiezza di movimento di scansione e può essere più irregolare 8. Software come celest ha lo scopo di colmare il divario per l'analisi dettagliata del C. elegans comportamento in un liquido, Permitting quantificazione dei parametri di movimento associata che non sono facilmente misurato dal occhio non-aided, o che può essere realizzato più rapidamente di scoring manuale. In 8 dura h un individuo in grado di elaborare fino a 200 video, ~ 1.000 record al giorno.
Il software definisce nuoto parametri che valutano che servono come un'impronta digitale completa di forma fisica e il comportamento. Oltre ad arricchire comprensione dei complessi aspetti del comportamento C. elegans in liquidi e loro percorsi molecolari sottostanti, questo software può essere utilizzato per esplorare molteplici aspetti della biologia comprese le risposte farmacologiche, invecchiamento e comportamenti distinti. Presentato qui, la panoramica dei cambiamenti che si verificano quantificati nella prestazione fisica di C. elegans adulti in quanto l'età è un esempio di tale applicazione del software (per un resoconto più dettagliato, vedere Restif et al. 8). Nel contesto di invecchiamento, alcuni parametri misurati diminuiti mentrealtri aumentate o non hanno costantemente cambiamento del tipo selvatico. Le tendenze sono stati confermati in gran parte dal profilo computazionale di mutanti longevità, ed i profili relativi delle coorti ager graziosi e cattivi delle popolazioni della stessa età tenuti in condizioni ambientali uniformi. L'alta risoluzione del software può anche rivelare fenotipi sottili precedentemente sconosciuta in mutanti ampiamente caratterizzate (ad esempio, l'età-1 (hx546) nella figura 1).
Ci sono alcuni punti particolarmente critici del protocollo descritto. Il mantenimento di un ambiente a temperatura costante tra l'ambiente bagno e la cultura piatto ceppo è importante per nuotare riproducibilità, in modo da sperimentatori sono fortemente incoraggiati ad andare a grandi dolori per evitare sbalzi di temperatura casuali. mezzi nuotata devono essere alla stessa temperatura delle piastre. Allo stesso modo, attenzione alla dimensione delle gocce per il nuoto contribuirà a garantire la riproducibilità. Infine, è prudente pensareanticipo lo scarico delle grandi file video che si accumulano. Si raccomanda l'elaborazione di immagini su un sito a parte il computer di acquisizione video.
L'utilizzo del software qui presentato per l'analisi nuotata ha alcune limitazioni. In primo luogo, anche se i programmi possono contemporaneamente monitorare più animali, se più di cinque animali vengono analizzati congiuntamente, vi è una maggiore probabilità che gli animali potranno nuotare attraverso l'un l'altro nelle immagini video. Quando il programma non può inequivocabilmente determinare quale animale era che, si censura quei frame di dati. Anche se questa caratteristica del programma assicura che i dati per i singoli animali sono di alta qualità, limita il throughput. In secondo luogo, le immagini dovrebbero essere abbastanza pulito, che è privo di polvere, macchie e abbagliamento da luci, come segnali associati possono anche confondere l'analisi delle immagini. Come osservato nella sezione 2.1.1 del protocollo, un investimento molto low-tech che può aiutare notevolmente la cattura delle immagini, eliminando complicazioni con le fluttuazioni in illuminazione ambientale è quello di coprire l'area palco con un panno scuro che non permette la luce ambientale per raggiungere la fase. In terzo luogo, il programma è ottimizzato per gli animali a stadio adulto. Giovani larve nuotare molto veloce e hanno piccoli corpi, che aumenta errore di programma. In quarto luogo, alcuni dei software utilizza MATLAB, e quando ci sono aggiornamenti di versione e / o aggiornamenti del sistema operativo, alcuni collegamenti programma può essere interrotto. Attualmente, il software è ottimizzato per l'uso su MATLAB 2015b e Mac OS versione 10.10, ma ci aspettiamo presto per pubblicare una versione del software che è più robusto contro tali cambiamenti. Infine, i file di dati video può diventare grande in fretta, e richiedono lo spazio di archiviazione da assegnare.
In sintesi, qui presentata è una semplice metodologia che può essere facilmente implementata da qualsiasi laboratorio senza molto investimento per creare video di C. elegans di nuoto per l'analisi celest. Caratteristiche del pacchetto software includono una forte automazione dal monitoraggio attraversol'analisi, il monitoraggio simultaneo multi-animale, e l'uso di basi matematiche (ad esempio, misure curvatura) per la quantificazione della maggior parte dei parametri di locomozione. Il software è open source, con il codice e demo a disposizione del pubblico, come indicato nella Restif et al. 8. Anche se il programma funzioni avanzate di analisi di computer vision per il monitoraggio, altri sistemi di tracciamento pubblicato (ad esempio, Greenblum et al. 2014 38) sono compatibili con l'analisi dei parametri del software qui presentata. Miglioramenti futuri saranno indirizzati verso la conversione del software in un pacchetto più robusto che non limita l'uso alle versioni specifiche dei sistemi operativi sopra citati (anche indicati nella tabella dei materiali).
Acknowledgments
sviluppo celest stato sostenuto da NIH concede R21AG027513 e U01AG045864. Dati e alcune rappresentazioni brevi video sono adattati da Restif et al. (2014) 8, che sono stati pubblicati sotto la licenza Creative Commons Attribution (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Ringraziamo Ricardo Laranjeiro aiuto manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans WT (ancestral). | |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
| OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
| Nematode Growth Medium (NGM) | For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
| M9 buffer | For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
| EQUIPMENT | |||
| CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
| MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
| Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
| Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
| Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |
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