Summary
Uma metodologia eficiente e simples para a análise baseada em computador do comportamento de natação nematóide em líquido é descrito. O método requer pouco ou nenhum investimento para C. elegans laboratórios. O hardware utilizado é padrão, e o software de computador para a análise comportamental (CELEST) é uma fonte aberta um.
Abstract
Dissecando os circuitos neuronais e neuromusculares que regulam o comportamento continua a ser um desafio importante na biologia. O nematóide Caenorhabditis elegans tem provado ser um organismo modelo valioso para ajudar a enfrentar este desafio, de inspirar abordagens tecnológicas, construindo o conectoma cérebro humano, para realmente lançar luz sobre os drivers moleculares específicas de padrões funcionais básicos. A maior parte dos estudos comportamentais em C. elegans foram realizados em substratos sólidos. No líquido, animais exibem padrões de comportamento que incluem o movimento a uma gama de velocidades em 3D, bem como os movimentos do corpo parciais, como uma onda posterior, sem alteração da forma anterior, que introduzem novos desafios para a quantificação. Os passos de um procedimento simples, e uso de um software que permite a análise de alta resolução de C. elegans nadar comportamento, são aqui apresentados. O software, chamado CELEST, usa um programa de computador especializado que rastreiavários animais ao mesmo tempo e proporciona novas medidas de C. elegans locomoção em líquido (natação). As medidas são principalmente fundamentada na postura dos animais e com base em matemática utilizados em visão computacional e reconhecimento de padrões, sem requisitos computacionais para limiar cut-offs. A ferramenta de software pode ser usado tanto para avaliar a aptidão geral de natação em centenas de animais provenientes de ensaios pequeno lote combinados e revelar novos fenótipos, mesmo em mutantes genéticos bem caracterizados. A preparação de amostras para análise com CELEST é simples e de baixa tecnologia, permitindo ampla adaptação pela comunidade científica. Utilização da abordagem computacional descrito aqui deve, portanto, contribuir para a maior compreensão do comportamento e circuitos comportamentais no modelo C. elegans.
Introduction
Definindo como o comportamento genética, epigenética, experiência e ambiente de influência é um grande desafio para a biologia moderna. Simples, modelos geneticamente susceptíveis que podem ser computacionalmente rastreados e medidos podem fazer contribuições importantes em direção a esse objetivo. O nematóide Caenorhabditis elegans é um tal modelo. O objetivo deste artigo é demonstrar como C. elegans natação locomoção pode ser rastreado e quantificadas para extrair informações sobre oito características inovadoras com relevância biológica.
C. elegans tem um tempo de vida relativamente curto de cerca de 2-3 W e um período de reprodução de aproximadamente 4 d a 20 ° C 1,2. Em culturas de laboratório padrão, esse nematóide microscópica é cultivado em placas de Petri contendo Nemátodo Crescimento mídia (NGM) que estão espalhados com uma fonte de alimento bacteriana 3,4. animais WT N2 mover activamente em ondas senoidais elegantes em placas cheio de agar; eles mudam o movimento do ratoes em roaming (busca de alimentos), habitação (de navegação), ou se recuperando de uma refeição (quiescência saciedade inativo) 5. Impairment 6 ou 7-12 idade também pode alterar drasticamente o movimento em placas.
Os genes que modulam o comportamento, healthspan ou envelhecimento, pode ser caracterizada funcionalmente através da análise de C. elegans padrões de movimento ou locomoção. Uma abordagem para medir healthspan é classificar envelhecimento adultos em três categorias (por exemplo, A, B, e C) de acordo com sua locomoção em placas, com atividade vigorosa física sendo a classe A e paralisia sendo classe C 7,8,13. Embora essa classificação qualitativa é útil para revelar as diferenças de aptidão física, as categorias são amplas, sem limites claros e, assim, a sua pontuação está sujeita a experimentador viés.
Um número crescente de trackers têm elevado a objetividade, sofisticação e precisão da análise de C. elegans movimentoem meios sólidos 14-18. C. elegans em placas de locomoção está principalmente restringida ao plano no qual o animal entra em contacto com a superfície sólida dos meios de comunicação. (C. elegans pode também induzir a exploração por levantar a cabeça do resto do corpo, que ainda está em contacto com uma superfície sólida, o posicionamento do corpo em vários planos. No entanto, este comportamento é incomum.) Quando colocadas no estado líquido, este nematóide inicia um movimento ondulatório, ou a natação, que possui movimento mais extensa dimensional, uma maior gama de velocidade e profundidade do movimento, e um aumento da incidência com a idade de movimento anterior de forma diferente a partir de posterior em comparação com animais em superfícies sólidas. Como uma rápida análise da aptidão física e da resposta ao novo ambiente, um experimentador pode colocar um animal em uma gota de líquido e marcar a sua frequência de curvas corporais no âmbito de dissecação. A gravação de vídeo pode facilitar scorings presentes e futuras do vigor de natação doanimal. No entanto, a abordagem manual limita o número de recursos que podem ser marcados, e está totalmente restrito a marcar um animal de cada vez.
Locomotion em líquido tem sido menos explorada do que a locomoção em meios sólidos. De fato, há poucas opções de software que são robustas e fáceis de implementar no laboratório para medir a locomoção em líquido 19-24. O CELEST software (C. elegans Swim Test) oferece simplicidade de medidas de uso e matemáticos com base em que entregam dados (pontuações curvatura) diretamente relevantes para a natureza do movimento 8; (descrição detalhada de características e vantagens em Restif et al. 8). Além disso, a análise computacional permite a elucidação de características fenotípicas que são impossíveis para o olho humano para marcar. Aqui, os dados que exemplificam a resolução desta abordagem de análise são apresentados e um fácil de implementar o protocolo para gravar testes de natação para análise CELEST subsequente é descrito.
Protocol
1. Crescimento Nematóides e Manuseio
- Crescer C. elegans em placas de Petri padrão contendo NGM manchado com OP50-1 Escherichia coli como fonte de alimento 1-3.
- Manter as culturas numa incubadora que mantém a temperatura desejada. C. elegans cresce bem a partir de 15 a 25 ° C, com 20 ° C, sendo a temperatura de crescimento padrão.
NOTA: A natação é um fenótipo robusta, no entanto nadar vigor pode ser afetada por fatores ambientais, incluindo a contaminação em placas e superaquecimento das culturas e slides. grandes esforços para manter condições estáveis devem ser feitas. - Use uma pick nematóide caseiro feito de um fio de platina chama-selada em uma vareta de vidro para lidar com transferência de animais individuais 4.
2. Defina-se para Análise Swim
- Use um sistema integrado que consiste de um microscópio estereoscópico, câmera CCD digital e software de gravação de vídeo digital. A ca software CELESTn ser utilizado em um computador separado.
- Cubra o microscópio com um pano escuro (por exemplo, sentiu) para evitar reflexos na área para soltar a nadar na lâmina de microscópio e melhorar a qualidade da imagem.
- Ajuste a distância de trabalho do microscópio e ampliação para visão completa da área de mergulho, eo espelho de base para obter nítido contraste dos animais contra o fundo. Definir a iluminação de campo escuro para visualizar os corpos dos adultos branco contra o fundo negro, que funciona muito bem para a visualização computacional e acompanhamento com o software de análise de mergulho.
- Tome cuidado para manter a área de trabalho, lâmina de microscópio, e nadar cair muito limpo. Detritos podem interferir com a análise pela oclusão da natação livre dos adultos e finos fios de fibra pode ser detectado como inertes animais durante o rastreamento.
3. Preparação de animais para Análise de Aptidão Física de líquido
- Pipetar 60 ul óf tampão 1x M9 num anel de 10 milímetros pré-impresso sobre uma lâmina de microscópio. Certifique-se a queda cobre totalmente a área dentro do anel. O software extrai mais informações natação usando este tamanho de gota contidos em um slide do que seria se utilizando placas com múltiplas cavidades.
- Escolha nemátodos adultos individuais e transferi-los para a gota de tampão 1x M9, minimizando o transporte de bactérias que podem obscurecer o líquido. Minimizar bactérias por em primeiro lugar colocar os animais para transferência para um dos lados da placa que não contêm muito camada bacteriana, permitindo-lhes rastrear, e então suavemente levantá-las.
- Ao transferir os nemátodos na gota, usar um escopo de dissecação perto da estação de análise para reduzir a duração do tempo de natação, o que pode afectar o comportamento dos animais 25.
- Coloque apenas 4 adultos na queda, se eles se movem vigorosamente e se cruzam frequentemente. A título de orientação para minimizar nadadores sobreposição (que confunde análise computacional), considere colocar4 animais por queda quando eles são tão activa como jovens, adultos WT saudáveis e 5 animais por queda quando forem mais velhos e mostrar menos vigor.
NOTA: nematóides WT Saudável instintivamente começar a nadar logo depois de ser colocado em líquido. Com a ajuda de uma picareta nematóide, delicadamente separar os adultos na queda se aglutinar.
4. Análise de Aptidão Física de líquido - Gravação de Vídeo de Natação
- Posicionar o slide carregado com adultos na base do microscópio para gravar seu natação. 30 s detalhes de captura de vídeos do comportamento de um animal individual no estado líquido (vídeo 1) e amostragem de um grande número de tais registros é facilmente realizado quando auxiliado por software CELEST 8,26; no entanto, mais nadar períodos pode ser ideal para outros estudos comportamentais específicas 25. Importante, certifique-se de manter a mesma ampliação em todas as gravações já que as diferenças de ampliação affecanálise de natação t e comparação viés vontade.
NOTA: Estes passos são fornecidos como orientação usando o software de gravação de vídeo digital listadas na Tabela de Materiais; VirtualDub software livre acesso pode substituir, embora não tenhamos testado esse.- Use as seguintes configurações como orientação para a análise de natação bem-sucedido: o tamanho da imagem de 696 x 520 pixels, resolução de imagem de 0,02 mm / pixel, e uma taxa de 18 frames / s. versões de maior resolução dessas configurações pode facilitar o acompanhamento, mas não afetará as medidas calculadas pelo programa.
NOTA: A zona de mergulho fornecida pela queda de 60 ul de 1x tampão M9 na lâmina de microscópio não tem muita profundidade, o que minimiza o movimento para cima e para baixo de natação.
- Use as seguintes configurações como orientação para a análise de natação bem-sucedido: o tamanho da imagem de 696 x 520 pixels, resolução de imagem de 0,02 mm / pixel, e uma taxa de 18 frames / s. versões de maior resolução dessas configurações pode facilitar o acompanhamento, mas não afetará as medidas calculadas pelo programa.
- Em Configurações, vá para 'Gravar', definir 'Limite de tamanho de Sequência de' a '545 quadros no disco'. Sob o mesmo título, marque a caixa "Use Recording Manager '. Clique no botão 'recor atual Editarding roteiro ... 'botão, e sob' Comandos ', selecione' Quadro Grab ', e em "condições stop', digite 'Parar após 0: 00: 30.00'.
- Para gravar, selecione 'New Sequence na RAM' sob o título para casa, em seguida, pressione o botão 'Record' vermelho. O software vai agarrar a 545 quadros com mais de 30 s com a câmera digital e mantê-los na memória RAM.
5. Análise de Aptidão Física de líquido - Tratamento de Vídeo
- Fragmentar o vídeo em uma sequência de quadros de imagem clicando no título da casa e selecionando "sequência completa Exportar para ..." no software de gravação de vídeo.
NOTA: O software de gravação de vídeo digital pode salvar os quadros como .bmp, .jpg, .tif, ou .png, todos os quais podem ser lidos pelo programa de análise nadar aqui apresentados. Note-se que .tif usar mais espaço de armazenamento, mas alguns formatos, como .jpg pode degradar a qualidade da imagem. - Inicie o programa de análise de mergulho a partir do MATLAB by clicando no botão Executar.
- Na tela inicial do programa de análise de mergulho, utilize o 'Adicionar um vídeo "ou" Adicionar vários vídeos de botões para fazer upload de sequências de imagem molda um de cada vez ou em grupos, enquanto colocação dos rótulos relevantes, tais como o genótipo, data, julgamento e duração . O software cria uma base de dados das sequências marcadas.
- Ativar o acompanhamento simultâneo de vários animais nas sequências enviados ao clicar em "1. vídeos processo ". Na nova tela, selecionar os vídeos desejados na caixa à esquerda e clique "Adicionar à lista". Para cada vídeo, clique em seu nome na lista top direita para exibir a primeira imagem do vídeo no canto inferior direito. Demarcar a zona de mergulho, selecionando 3 pontos dentro do ringue, e iniciar o processo clicando em "Processo de todos os vídeos listados acima. Ver o progresso do processamento na parte inferior central.
- Depois de concluído, 'Close' tela de processamento de vídeo.
6. Análise de Aptidão Física de líquido - Medição
- Clique em '2. medidas de computação "para abrir uma nova tela onde os vídeos processados podem ser carregados, um de cada vez, para validar ou rejeitar o rastreamento de animais individuais. Vídeos que foram processados aparece na lista à esquerda, onde o nome do vídeo pode ser clicado para carregar esse vídeo.
- Utilize este passo manual para se concentrar em áreas de rastreamento (blocos vermelhos) perdidas em contraste com rastreamento bem sucedido (blocos verdes).
NOTA: Como alternativa, pode-se contar com a saída automatizada de acompanhamento válido desde que o software tem um sistema de rastreamento robusto (94,1% validade como observado em 2.020 animais de 404 vídeos 8).- Encontrar o "Validade do corpo segmentado 'na primeira barra de cores em toda a tela na metade inferior. A percentagem de 'frames válidos' está em verde, ea percentagem de 'frames rejeitado "está no vermelho. ≥80% de quadros válidos implica que o i rastreamentonformação usado para calcular medidas vem de, pelo menos, 432 quadros em cada 540 em um 30 s nadar julgamento gravada em 18 quadros / s.
- Facilmente navegar e modificar blocos de válido / rejeitado quadros utilizando o 'Next block', 'Mudar validade "," bloco Dividir', e as opções de "quadro isolar". No caso raro que 2 animais cruzaram em uma zona de natação uncrowded, mudar seus números de identificação ao longo de um intervalo de quadro específico com o botão 'Mudar'.
- Veja os gráficos de barras na metade inferior da tela para obter informações adicionais sobre rastreamento e performances que se sobrepõem. O comprimento do corpo segmentado (do animal comprimento do corpo por quadro) correlaciona-se com sobreposição de incidência.
- Se todos os pontos brilhantes no vídeo interferir com a análise, ajuste áreas brilhantes na zona de mergulho, seleccionando a função das zonas de Brilho '.
- Clique em "Salvar e medidas de computação 'para salvar a entrada de validade antes de secarregar outro vídeo processado. Nesta fase, o software calcula, no fundo (não mostrado para o usuário), mapas curvatura do desempenho de natação individual dos animais e os parâmetros indicados abaixo (Video 2).
NOTA: Os parâmetros medidos que estão focados em aqui estão descritos na Tabela 1. The Wave taxa de iniciação, número de onda do corpo, assimetria, estiramento, e curling são calculados com base nos mapas de curvatura que o software calcula para os animais; A velocidade de marcha, Pincelada e atividade parâmetros de índice não são baseadas em mapas de curvatura. - Clique em "Fechar" para sair da tela das medidas de computação ".
7. Análise de Aptidão Física de líquido - Saída de Resultados
Nota: O software pode gerar relatórios em vários medidas do movimento de natação, que cobrem a partir evidentes para muito sutil traços comportamentais que não são facilmente marcados por olho (Videos 3 e 4). aqui ofoco está em 8 parâmetros que mostram geralmente uma boa gama dinâmica: Onda de taxa de iniciação, número de onda do corpo, assimetria, estiramento, ondulação, velocidade de deslocamento, Pincelada, e índice de atividade.
- Na tela inicial do programa, clique em "3. Mostrar resultados "para obter a saída de análise.
- Criar grupos de amostra para tratamento estatístico, selecionando as sequências analisadas desejado de quadros na caixa à esquerda e movê-los em um grupo de amostra nova ou já existente, clicando em "Adicionar à amostra selecionada" ou "Adicionar a nova amostra 'botões.
- Clique em "mostrar gráficos para estas amostras 'para ir para uma segunda tela que exibe os gráficos e estatísticas-chave das amostras para cada um dos 8 parâmetros de seleção no topo da tela.
- Se desejar, ajustar a representação dos gráficos de barras no canto superior esquerdo da tela usando as 'Cores', '# de histogramas' e '# de Worms' seletores.
- Usar'Histogramas 2D' para traçar combinações de quaisquer dois parâmetros através do "Medida no eixo X 'e' Medida no eixo Y 'menus à esquerda da tela. Clique em "Fechar" para sair e retornar à tela dos resultados de exibição ".
- Use o "Exportar ..." botão no canto superior esquerdo da tela para salvar os dados numéricos detalhados como arquivo .csv para abrir e ainda manipular em um programa de planilha.
- tela 'Fechar' dos resultados de exibição "para voltar à tela inicial e clicar em 'Sair' para garantir a poupança do banco de dados que contém as sequências de vídeo analisadas.
Representative Results
Ao analisar a locomoção em líquido (natação), fenótipos que não são facilmente perceptível em meio sólido (rastreamento) pode ser elucidado. Para quantificar a natação locomoção foi desenvolvido um software específico que mede dez novos parâmetros de comportamento de natação 8. O oito mais útil destes parâmetros são descritos em detalhe na Tabela 1. Estes parâmetros são nomeados de Ondas taxa de iniciação, número de onda do corpo, Assimétrico, Stretch, Curling, velocidade de viagem, curso da escova, e índice de atividade. Estudos exemplificando o poder do software ter definido o declínio funcional de centenas de envelhecimento adultos com WT, fundos mutante comportamentais ou longevidade 8, e analisaram o bem estudado mutantes longevidade idade-1 (hx546) e daƒ-16 (mgDƒ50), que abrigam mutações que perturbam a via normal de sinalização da insulina. A idade-1 gene codifica para uma phosphatidylinositide 3-quinase (PIK3) Subunidade catalítica, e, quando se abriga o hx546 mutação, provoca extensão vida útil e resistência ao estresse 27-29. O gene daƒ-16 codifica um fator de transcrição box forkhead O (FOXO) que encurta a vida útil e prejudica a resposta ao estresse, quando excluídos 30-33.
Certos parâmetros de natação como a onda taxa de iniciação, velocidade de viagem, escova de acidente vascular cerebral e índice de atividade diminuiu gradualmente com a idade mesmo em origens genéticas favoráveis (Figura 1). De acordo com o conhecimento actual, de longa duração idade-1 (hx546) mutantes mostraram um desempenho físico mais vigoroso do WT em idades avançadas e extremamente antigas. Além disso, como esperado, de curta duração daƒ-16 (mgDƒ50) mutantes apresentaram comprometida desempenho, especialmente em idades extremamente antigos. Notavelmente, foi apenas sob o escrutínio da visão de computador CELEST e pacote de algoritmo matemático que o superior desempenho mergulho de idade 1-(hx546) mutantes foi detectável no início da idade adulta. O fato de que resulta em melhoria do rendimento físico na vida adulta jovem idade-1 (hx546) sugere que esta mutação afeta o desenvolvimento normal e / ou fenótipo jovem adulto de uma maneira apreciada não previamente (Figura 1).
Número de corpo onda, Assimetria, esticar e ondulação parâmetros tenderam-se com a idade em WT e adultos envelhecimento mutantes (Figura 2). Curiosamente, o nível de resolução do software revelou características comportamentais mais finos como a simetria sustentada de mutantes ao longo do seu tempo de vida e a incapacidade de daƒ-16 mutantes (mgDƒ50) antigos extremas idade-1 (hx546) para esticar e enrolar-se na medida em que a mesma adultos -Idade WT e idade-1 (hx546) fazer.
Para além da inevitável perda global de perfo físicarmance devido à idade, cada indivíduo adulto exibe um padrão de progressão única através do processo de envelhecimento, mesmo quando a genética eo ambiente são praticamente homogênea 7. (Ao controlar a genética eo ambiente, os possíveis efeitos de confusão desses fatores são minimizados, revelando a contribuição significativa da stochasticity à degeneração relacionada à idade.) A C. elegans população sincronizada de fundo genético semelhante mantidos em um ambiente controlado ainda contém uma mistura de diferentes classes de pessoas de acordo com suas peculiaridades envelhecimento. Apesar de todo o começo adultos saudáveis, alguns rapidamente perder sua aptidão física (maus gestores, classe C), enquanto outros manter o vigor por um período maior de tempo (agers graciosas, classe A). Bad agers, portanto, parecem ter um healthspan consideravelmente mais curto do que agers graciosas.
Conforme detalhado no nosso estudo 8, agers graciosas mantida fitn física juveniless como observado por comparação com o perfil de mergulho dos adultos mais jovens (Figuras 3, 4 e 5). Esta aptidão sustentado é comparável ao desempenho físico de-1 Idade (hx546) mutantes de longa duração na idade pós-reprodutiva (D 11) (Figuras 1 e 2). Pelo contrário, agers ruins dramaticamente perderam muito de sua capacidade física logo após a reprodução, desempenho em níveis semelhantes aos dos adultos extremos de idade e progeric daƒ-16 (mgDƒ50) (Figuras 1 - 4). Essas semelhanças podem ser tiradas por comparação bruta, no entanto particular de assinaturas são facilmente perceptíveis em um olhar mais atento. Por exemplo, embora haja alguma correlação entre a extensão de ambos estiramento e enrolamento em tipos selvagens velhos extremas e envelhecimento mutantes (Figura 2), esta relação não se observa em maus gestores (Figuras 4 e 5), que apresentam maior propensão para enrolar -se, maspara não esticar nas amostras testadas. O software apresentamos acrescenta, assim, dimensão à análise da aptidão física ou a capacidade locomotora, fornecendo as ferramentas para estudos mais sofisticados que não eram tratáveis antes. Em resumo, CELEST fornece leituras abrangentes em forma de oito novas medidas destacadas aqui, que definem a impressão digital comportamental específica genética, epigenética, e fundos ambientais, permitindo a identificação de padrões de parâmetros únicos e comuns que podem ser as assinaturas de condições específicas ( ambiental, farmacológicos, nutricional), processos biológicos, ou organismo estados como healthspan.
Figura 1: CELEST Reports Software na onda Iniciação Rate (A), Índice de Atividade (B), Pincelada (C) e Viagens velocidade (D) para o WT, idade-1 (hx546) e daƒ-16 (mgDƒ50) Adultos em D 4 (início da vida adulta), 11 (pós-reprodução) e 20 (extrema idade). '#' Em 'número' y meios de eixo. WT são coloridos em cinza, idade-1 em verde e daƒ-16 no vermelho. As barras de erro são o erro padrão da média (SEM). WT da mesma idade e do envelhecimento mutantes foram comparados para significância estatística usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 em cada ponto de dados de quatro ensaios independentes. Note-se que aqui, e para a Figura 2, cada um de 30 s de vídeo é feita com 4 animais, e para cada ensaio que marcar um total de 16 animais, a partir de 4 vídeos de natação, isto é feito em 4 réplicas biológicas para cada ponto de dados mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Relatórios de Software na onda do corpo Number (A), Assimétrico (B), Stretch (C) e Curling (D) para o WT, idade-1 (hx546) e (mgDƒ50) Adultos em D 4 16 daƒ-(jovens idade adulta), 11 (pós-reprodução) e 20 (extremo de idade). '#' Em 'número' y meios de eixo. WT são coloridos em cinza, idade-1 em verde, e daf-16 em vermelho. As barras de erro são o erro padrão da média (SEM). WT da mesma idade e do envelhecimento mutantes foram comparados para significância estatística usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. *, P = 0,01 - <0,05; **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. N = 62 em cada ponto de dados a partir de quatro independente, 30 s nadar ensaios.E.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Relatórios de Software na onda Iniciação Rate (A), Activity Index (B), Pincelada (C), e do curso de velocidade (D) para jovens adultos WT (D 4), e da mesma idade Gracioso e Bad Agers (D10 e 11). '#' Em 'número' y meios de eixo. WT jovens são coloridos em cinza, classe A agers graciosas no verde, e da classe C maus agers em vermelho. As barras de erro são o erro padrão da média (SEM). Classe A agers graciosas e classe C maus agers foram comparados com D 4 adultos jovens usando o one-way ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. ****, P <0,0001. N = 27 em cada ponto de dados a partir de dois independente, 30 s nadar ensaios. Graph é ligeiramente modificado a partir Restif et al. (2014) 8, que foi publicado sob o criativoCommons Atribuição (CC BY) licença http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Relatórios de Software na onda do corpo Number (A), Assimétrico (B) e Curling (C) para Young WT Adultos (D 4), e Agers da mesma idade graciosas e Bad (D 10 e 11). '#' Em 'número' y meios de eixo. WT jovens são coloridos em cinza, classe A agers graciosas no agers verdes e classe C ruins em vermelho. As barras de erro são o erro padrão da média (SEM). Classe A agers graciosas e classe C maus agers foram comparados com D 4 adultos jovens usando o one-way ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. **, P = 0,001 - <0,01; ****, P <0,0001;
Figura 5: Relatório de software on-cola para jovens adultos WT (D 4), e-mesma idade Gracioso e Bad Agers (D 10 e 11). WT jovens são coloridos em cinza, classe A agers graciosas no agers verdes e classe C ruins em vermelho. As barras de erro são o erro padrão da média (SEM). Classe A agers graciosas e classe C maus agers foram comparados com D 4 yadultos de Oung que usa ANOVA one-way, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. N = 27 em cada ponto de dados a partir de dois ensaios independentes. Graph é ligeiramente modificado a partir Restif et al. (2014) 8, que foi publicado sob o http licença Creative Commons Attribution (CC BY): /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Video 1: Natação de um grupo representativo de C. elegans adultos. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).
Vídeo 2: CELEST Software Computação de Mapas Curvatura individuais das Performances de natação dos animais testados. mapas de curvatura são computados no fundo; eles não aparecem na interface do software com o usuário. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).
Vídeo 3: cálculo Software de Medidas de natação com base em individuais Curvatura Maps. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).
Video 4: Cálculo Software de Medidas de natação que não dependem de curvaturaMapas. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).
Discussion
O uso de C. elegans como um sistema modelo continua a aumentar devido à sua maleabilidade genética, tractability experimental e anatomia anotada ao detalhe meticuloso. Por exemplo, a estrutura neuronal e conectividade do C. elegans hermafrodita é claramente traçada 34-36, facilitando bastante investigações de circuitos neuronais específicos que controlam comportamentos específicos. 302 neurônios constituem o sistema nervoso do hermafrodita adulto, que processa uma ampla gama de entradas sensoriais em outputs comportamentais básicas, como a locomoção. A estrutura do sistema nervoso macho mais complexo também tem sido descrita 37, permitindo que os circuitos específicos do sexo a ser tratada. 37
C. elegans comportamento tem sido extensivamente estudada em placas de cultura padrão contendo meios sólidos. Desde WT de C. elegans se move em ondas senoidais previsíveis em placas encheu-agar, desvios em relação àpadrão global pode ser detectada a olho nu e teve manualmente. Esta abordagem, no entanto, está sujeita a critério do experimentador e é um trabalho intensivo. Ferramentas de hardware e software projetados para acompanhar e medir C. elegans locomoção em meios sólidos remover a polarização subjetividade e permitir estudos em grande escala, permitindo questões biológicas mais sofisticados a serem abordados. A base de dados de comportamento recente criado pelo laboratório Schafer 16 é um excelente exemplo da extensão e profundidade analítica que foi alcançado com um sistema computacional de locomoção em placas.
Quando WT C. elegans é colocado em líquido, o animal se adapta rapidamente a sua proposta para o novo ambiente, iniciando um mergulho. C. elegans natação utiliza uma maior amplitude de movimento de rastreamento e pode ser mais irregular 8. Software como CELEST destina-se a preencher a lacuna para a análise detalhada de C. elegans comportamento no líquido, permiquantificação tting de parâmetros associados ao movimento que não são facilmente medidos pelo olho-aided un, ou que podem ser realizadas mais rapidamente do que de pontuação manual. Em 8 duro h um indivíduo poderia processar até 200 vídeos, ~ 1.000 registros por dia.
O software define natação parâmetros que avaliam que servem como uma impressão digital abrangente de aptidão física e comportamento. Além de enriquecer a compreensão das facetas complexas de C. elegans comportamento em líquido e suas vias moleculares subjacentes, este software pode ser usado para explorar vários aspectos da biologia, incluindo respostas farmacológicas, envelhecimento e comportamento distinto. Apresentado aqui, a visão geral das mudanças quantificados que ocorrem no desempenho físico de C. elegans adultos com a idade é um exemplo de tal aplicação do software (para uma descrição mais detalhada, consulte Restif et al. 8). No contexto do envelhecimento, alguns parâmetros medidos diminuiu enquantooutros aumentada ou não consistentemente mudar de tipo selvagem. Tendências foram confirmadas em grande medida pelo perfil computacional de mutantes longevidade, e os perfis relativos de coortes ager graciosas e ruins das populações da mesma idade mantidos em condições ambientais uniformes. A alta resolução do software também pode revelar fenótipos subtis anteriormente desconhecido em mutantes extensivamente caracterizadas (por exemplo, idade-1 (hx546) na Figura 1).
Existem algumas etapas particularmente críticas do protocolo descrito. A manutenção de um ambiente de temperatura constante entre o ambiente aquático ea cultura em placa de tensão é importante para mergulho reprodutibilidade, então experimentadores são altamente incentivados a ir para um grande esforço para evitar mudanças de temperatura aleatórios. meios de natação deve estar na mesma temperatura que as placas. Da mesma forma, cuidadosa atenção ao tamanho da gota para a natação vai ajudar a garantir a reprodutibilidade. Finalmente, é prudente pensar emavançar sobre o descarregamento de grandes arquivos de vídeo que se acumulam. Processamento de imagens em um site para além do computador de captura de vídeo é recomendado.
O uso do software de análise aqui apresentada para nadar tem certas limitações. Em primeiro lugar, embora os programas podem rastrear simultaneamente vários animais, se mais de cinco animais são analisadas em conjunto, há uma maior chance de que os animais vão nadar em uns aos outros nas imagens de vídeo. Quando o programa não pode inequivocamente determinar qual animal era que, ao que censura os quadros de dados. Embora esse recurso programa garante que os dados para os animais individuais são de alta qualidade, que limita a taxa de transferência. Em segundo lugar, as imagens devem ser bastante limpo, livre de poeira, manchas e brilho das luzes, como sinais associados também podem confundir a análise de imagem. Como observado na seção de protocolo 2.1.1, um investimento muito baixa tecnologia que pode ajudar muito a captura de imagem, eliminando complicações com as flutuações in iluminação ambiental é para cobrir a área do palco com um pano escuro que não permite que a luz ambiente para atingir o estágio. Em terceiro lugar, o programa é otimizado para animais na fase adulta. mergulho larvas jovens muito rápido e têm corpos pequenos, o que aumenta erro de programa. Em quarto lugar, alguns dos softwares utiliza MATLAB, e quando há atualizações de versão e / ou atualizações do sistema operacional, alguns links de programas podem ser interrompidos. Atualmente, o software é otimizado para uso em MATLAB 2015b e Mac OS versão 10.10, mas esperamos em breve para deixar um versão do software que seja mais robusto contra tais mudanças. Finalmente, os arquivos de dados de vídeo podem se tornar grandes rápido, e necessitam de espaço de armazenamento a ser alocado.
Em resumo, apresentado aqui é uma metodologia simples que pode ser facilmente implementado por qualquer laboratório, sem muito investimento para criar vídeos de C. elegans natação para análise CELEST. Características do pacote de software incluem automação extensiva de rastreamento atravésanálise, acompanhamento multi-animais simultânea e uso de bases matemáticas (ou seja, as medidas de curvatura) para quantificação de a maioria dos parâmetros de locomoção. O software é open source, com código e demos à disposição do público, conforme detalhado no Restif et al. 8. Embora o programa apresenta a análise da visão de computador avançado para acompanhamento, outros sistemas de rastreamento publicada (por exemplo, Greenblum et al., 2014 38) são compatíveis com a análise de parâmetros do software aqui apresentado. Futuras melhorias será voltada para converter o software em um pacote mais robusto que não restringir o uso das versões específicas dos sistemas operacionais mencionados acima (também indicadas na Tabela de Materiais).
Acknowledgments
desenvolvimento CELEST foi financiado pelo NIH concede R21AG027513 e U01AG045864. Dados e algumas representações de vídeo curtos são adaptados a partir Restif et al. (2014) 8, que foram publicados sob a licença Creative Commons Attribution (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Agradecemos a Ricardo Laranjeiro para a ajuda manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans WT (ancestral). | |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
| OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
| Nematode Growth Medium (NGM) | For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
| M9 buffer | For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
| EQUIPMENT | |||
| CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
| MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
| Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
| Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
| Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |
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